孕期母體鎘暴露對C57BL/6小鼠肝臟和腎臟的組織特異性氧化損傷作用

郭慧琴，吳中強，毛秀麗，王歡，王蘭，許鵬,2

1.山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006；2.上海交通大學 Bio-X研究院，上海 200030

鎘是當今重金屬污染中涉及面積最廣、危害最大的重金屬元素之一[1]。鎘主要通過食物攝取、吸煙等方式進入人體，并且隨血液流動而在體內多種器官中積累并產生毒性效應。其中，鎘的生殖毒性近年來已成為研究熱點。研究顯示，鎘一方面可以抑制正常育齡男女的配子發生；另一方面可能會導致多種不良妊娠結局，如早產、胎兒生長受限等[2-3]。

胎兒生長受限與多種因素（母體因素、胎盤因素和胎兒因素）相關[4]。一系列流行病學調查結果和體內實驗結果顯示，胎盤可能是鎘誘發胎兒生長受限的毒性作用的主要靶器官之一[5-6]。我們的前期研究顯示，孕期母體鎘暴露的小鼠肝臟和腎臟中的鎘積累量遠遠高于胎盤[7]；并且，妊娠期母體肝臟和腎臟功能的異常有可能引起多種不良妊娠結局并對胎兒發育產生影響[8-10]。因此，對孕期鎘暴露的母體肝臟和腎臟的研究，可能有助于進一步闡明孕期鎘暴露致胎兒生長受限的毒性機制。目前，研究者普遍認為，由自由基介導的生物體內的氧化損傷是鎘毒性效應的主要體現。鑒于此，本研究利用課題組前期建立的孕期鎘暴露致胎兒生長受限小鼠模型，分別檢測鎘暴露小鼠肝臟和腎臟組織中抗氧化酶［超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）］活性、脂質過氧化水平（MDA含量）、蛋白質羰基化（PCO含量）水平和DNA-蛋白質交聯（DPC）的變化情況，旨在特異性檢測孕期鎘暴露對母體肝臟和腎臟的氧化損傷程度，從而為揭示孕期母體鎘暴露致胎兒生長受限作用的分子調控機理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

性成熟的8周齡C57BL/6小鼠（雄性小鼠體重25～28 g，雌性小鼠體重：0～23 g）購自北京生命河實驗動物中心。

氯化鎘（CdCl2·2.5H2O）（分析純，天津博迪化工有限公司）實驗前用蒸餾水配成20 000 mg/L的母液；標準鎘溶液（1000 mg/L，國家環境保護總局標準樣品研究所）；SOD、CAT、GPx、丙二醛（MDA）含量和總蛋白含量試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Tris、蛋白酶K和熒光染料Hoechest33258（Sigma公司）；鹽酸胍和EDTA（分析純，北京化工廠）；2，4-二硝基苯肼（DNPH）（分析純，天津Kermal化學試劑開發中心）。

1.2 實驗設計

C57BL/6小鼠嚴格按照中國輻射防護研究院動物倫理委員會制訂的實驗動物操作相關規范，在中國輻射防護研究院實驗動物中心進行小鼠的日常飼養和管理，飼養溫度為（23±1）℃，濕度為（60±5）% ，光照周期12 h/12 h，自由采食飲水，適應環境1周后開始進行合籠操作。合籠操作每天晚上9點開始（每籠中放置1只雄鼠與2～3只雌鼠），次日早晨7點檢查陰栓，以出現陰栓的當天作為妊娠第0.5 d（Embryonic 0.5，E0.5）。自E7.5開始，將45只體重相近的孕鼠分為3組，分別喂食0、20和40 mg/L氯化鎘（CdCl2）溶液。喂食的CdCl2溶液每天更換，并且用原子吸收儀對相關溶液進行檢測以確保濃度恒定。分別于E13.5、E16.5和E19.5收集各組小鼠的胎兒、胎盤、肝臟等組織標本，每一妊娠階段5只動物。通過比較各組小鼠在不同妊娠時期的胎兒數量、胎兒胎盤重量，確認孕期鎘暴露致胎兒生長受限動物模型建立成功。所有材料收集后立即置于液氮內凍存，以備后續實驗取用。

1.3 樣品制備及生理生化指標測定

將孕鼠的肝臟、腎臟組織按組織質量體積比（1 g/4 mL）加入磷酸緩沖液（PBS，pH7.4），電動勻漿器制備20% 的組織勻漿液，4℃、2500 r/min離心 10 min，取上清備用。SOD、CAT、GPx活性、MDA含量和蛋白含量采用試劑盒測定；PCO和DPC測定方法參見文獻[11]。

1.4 數據處理

所有實驗數據均采用SPSS 16.0軟件單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行統計分析，結果用x±SD表示，P＜0.05表示存在顯著性差異，P＜0.01表示存在極顯著性差異。

2 結果

本課題組的前期研究表明，孕期母體鎘暴露會導致妊娠末期（E19.5）胎兒重量顯著性降低[7]，因此本研究僅對E16.5和E19.5的小鼠肝臟和腎臟樣本進行檢測。

2.1 孕期母體鎘暴露對小鼠肝臟和腎臟組織抗氧化酶活性的影響

2.1.1 孕期母體鎘暴露對小鼠肝臟和腎臟組織SOD活性的影響 由圖1A、B可見，所有鎘處理組小鼠肝臟、腎臟組織中的SOD活性均高于對照組。E19.5時，40 mg/L鎘處理組小鼠肝臟組織中的SOD活性顯著性升高，而腎臟中的SOD活性無顯著性變化。

2.1.2 孕期母體鎘暴露對小鼠肝臟和腎臟組織CAT活性的影響 如圖1C、D所示，所有鎘處理組小鼠肝臟、腎臟組織中的CAT活性均高于對照組，表現出CAT活性隨染毒濃度的增加而逐漸升高，并隨染毒時間的延長而逐漸降低。E19.5時，20和40 mg/L鎘處理組小鼠腎臟組織的CAT活性呈顯著性或極顯著性升高；40 mg/L鎘處理組的肝臟組織CAT活性呈顯著性升高，而20 mg/L鎘處理組的肝臟組織CAT活性則無顯著性變化。

2.1.3 孕期母體鎘暴露對小鼠肝臟和腎臟組織GPx活性的影響 由圖1E、F可知，所有鎘處理組小鼠肝臟、腎臟組織中的GPx活性均高于對照組，GPx活性在小鼠肝臟組織中隨時間延長而逐漸降低，而在小鼠腎臟組織中隨時間延長而逐漸升高。在E19.5，20和40 mg/L鎘處理組小鼠肝臟和腎臟組織的GPx活性均表現為極顯著性增高。

圖1 孕期母體鎘暴露對小鼠肝臟（A、C和E）和腎臟（B、D和F）抗氧化酶活性的影響（n=5）

2.2 孕期母體鎘暴露對小鼠肝臟和腎臟組織MDA含量的影響

所有鎘處理組小鼠肝臟和腎臟組織中的MDA含量均高于對照組。在小鼠肝臟組織中，MDA含量隨鎘染毒濃度的增加而逐漸升高，隨時間延長而逐漸降低。20、40 mg/L鎘處理組小鼠肝臟的MDA含量在E16.5和E19.5時均呈顯著性或極顯著性升高；而20、40 mg/L鎘處理組小鼠腎臟的MDA含量僅在E19.5時呈極顯著性升高，而在E16.5時無顯著性變化（圖2A、B）。

圖2 孕期母體鎘暴露對小鼠肝臟（A）和腎臟（B）中MDA含量的影響（n=5）

2.3 孕期母體鎘暴露對小鼠肝臟和腎臟組織PCO含量的影響

圖3A、B顯示，所有鎘處理組小鼠肝臟、腎臟組織中的PCO含量均高于對照組，且隨鎘濃度增加而逐漸升高。E19.5時，20、40 mg/L鎘處理組小鼠肝臟和腎臟的PCO含量均呈顯著性或極顯著性升高。E16.5時，20和40 mg/L鎘處理組小鼠腎臟的PCO含量呈顯著性升高，40 mg/L鎘處理組小鼠肝臟的PCO含量呈顯著性升高。

2.4 孕期母體鎘暴露對小鼠肝臟和腎臟組織DPC的影響

圖4A、B表明，所有鎘處理組小鼠肝臟、腎臟組織中的DPC均高于對照組，表現出DPC隨染毒濃度和暴露時間的延長逐漸升高。E16.5時，40 mg/L鎘處理組小鼠肝臟和腎臟DPC與正常組相比，顯著升高；E19.5時，20、40 mg/L鎘處理組小鼠肝臟和腎臟的DPC與正常組相比，顯著升高。

圖3 孕期母體鎘暴露對小鼠肝臟（A）和腎臟（B）中PCO含量的影響（n=5）

圖4 孕期母體鎘暴露對小鼠肝臟（A）和腎臟（B）中DPC水平的影響（n=5）

3 討論

3.1 肝臟和腎臟可能是鎘誘發胎兒生長受限的毒性作用的主要靶器官

胎兒生長受限是圍產期常見的并發癥之一，在我國發病率約為6.39%[12]。該疾病不僅增加圍產期胎兒、嬰幼兒的發病率和死亡率，限制兒童期、青春期的體格和智能發育，還可能是成年期Ⅱ型糖尿病、肥胖癥、高血壓、冠心病及精神分裂癥等慢性疾病高發的重要誘因[12-13]。鎘是誘發胎兒生長受限的一類重要環境因素[2]，近年來，鎘致胎兒生長受限的毒性機制受到研究者的廣泛關注。然而，這些研究大都著眼于鎘在胎盤中的積累及其引起的胎盤病理性變化[5-6,14]，對其他因素的研究相對較少，如胎兒因素和母體因素。

母體因素也是胎兒生長受限的一類重要因素，妊娠期的各種并發癥（如妊娠高血壓）、母體的營養不良（如蛋白質和能量供應不足）都會對胎兒的生長發育產生影響[4]。肝臟和腎臟是母體的兩類重要代謝器官。妊娠期新陳代謝旺盛和雌激素分泌增多會加重肝臟和腎臟負擔，并導致其結構和功能發生很大的改變。更重要的是，患有肝病和腎病的孕婦在妊娠晚期時，容易發生一系列的肝臟和腎臟的病理性變化，產生多種不良妊娠結局（如產后出血、流產），并導致母嬰死亡率的提高[8-10,15-16]。巧合的是，我們前期研究發現，孕期母體鎘暴露小鼠的肝臟和腎臟的鎘積累量遠遠高于胎盤，并且在肝臟中的鎘積累量約為腎臟的2倍[7]。因此，母體的肝臟、腎臟可能是鎘誘發胎兒生長受限的毒性作用的主要靶器官，并且其毒性損傷效應也可能由于鎘積累量的不同而呈現組織特異性的變化。

3.2 孕期母體鎘暴露對小鼠肝臟、腎臟的氧化性損傷作用

鎘的毒性效應已有近150年的研究歷史，研究者也已經提出了多種分子機制來闡釋其毒性機理，其中氧化損傷機制受到絕大多數研究者的認同[17]。氧化損傷主要表現為2種方式：直接誘導生物體內產生活性氧、自由基代謝物；間接降低生物體清除氧自由基的能力[18]。后者通過作用于體內的抗氧化系統來完成。SOD、CAT和GPx是機體抗氧化系統中的3種重要酶類，SOD可清除O2-，將其轉化為H2O2；而CAT和GPX則可以將H2O2轉化成H2O和O2[19]。

本研究結果顯示，SOD活性變化較小，直到E19.5時，40 mg/L高濃度鎘處理組小鼠肝臟組織的SOD活性才發生顯著性升高。這可能是由于鎘暴露濃度相對較低，暴露時間較短，使得機體內未產生較高水平的O2-，無法激活2種組織SOD活性發生變化。而SOD活性僅在肝臟，而不是腎臟中發生顯著性變化，則可能是由于鎘在肝臟中的積累量遠遠高于腎臟所致[7]。E19.5的CAT活性較E16.5表現為降低趨勢，這與“促進-抑制”效應機制吻合，即低濃度鎘暴露時,可使生物體內的抗氧化酶活性升高，出現“毒性興奮效應”；而高濃度時,則通常會使生物體內的抗氧化酶活性受抑制而降低，生物體內活性氧過量積累，導致生物體損傷。與CAT活性表現不同的是，GPx活性在鎘暴露的小鼠肝臟，而不是小鼠腎臟中表現出“促進-抑制”效應，這可能也是由于鎘在肝臟和腎臟中的鎘積累量的差異[7]。此外，同一時間，隨著鎘濃度的增加，CAT的活性仍然呈升高趨勢，可能是因為鎘濃度在40 mg/L時，在E19.5沒有達到抑制CAT活性的程度，有利于MDA的清除。鎘對小鼠肝臟、腎臟抗氧化系統的破壞降低了細胞對氧自由基的清除能力，間接導致小鼠肝臟、腎臟組織的損傷[20]。

3.3 孕期母體鎘暴露對小鼠肝臟、腎臟的MDA、PCO含量和DPC的影響

鎘在生物體內大量積累，機體會產生過多的自由基，當抗氧化系統不足以清除體內自由基時，就造成機體氧化損傷，產生脂質過氧化反應。MDA是脂質過氧化反應的產物，其含量可以反映機體氧化損傷程度[21]。此外，鎘還能破壞核酸和蛋白質等生物大分子，對生物體產生毒性作用，因此，PCO含量和DPC水平也可以作為反映機體氧化損傷程度的指示物[22-23]。在本研究中，MDA、PCO含量和DPC水平均出現顯著升高。其中PCO含量和DPC水平隨鎘濃度的升高和（或）染毒時間的延長呈升高趨勢，這與前人的一些研究結果基本一致[24-27]。而在E19.5，小鼠肝臟的MDA含量相比于E16.5出現了降低的情況，可能與E16.5時小鼠肝臟的CAT活性仍然沒有被抑制有關。同時，該現象在小鼠肝臟，而不是腎臟中出現則可能與鎘在肝臟和腎臟中的鎘積累量的差異相關[7]。綜上所述，孕期母體鎘暴露對母體肝臟和腎臟產生嚴重的氧化損傷，進而可能對胎兒生長發育產生影響，不同組織的氧化損傷程度具有差異。

3.4 結論

肝臟和腎臟可能是孕期鎘暴露誘發胎兒生長受限的毒性作用的主要靶器官。

孕期鎘暴露不但能誘導母體肝臟、腎臟的氧化應激水平的升高，而且進一步導致了母體肝臟、腎臟中脂質、蛋白質和DNA生物大分子的損傷，上述指標的變化情況可以為解釋孕期母體鎘暴露致胎兒生長受限的分子調控機理提供科學依據。

孕期鎘暴露誘導的母體肝臟和腎臟的氧化損傷指標的變化具有組織特異性，這可能與鎘在母體肝臟和腎臟中的積累量不同有關。