一株吡咯喹啉醌產生菌的篩選和初步鑒定

楊亞欣，劉天，李彤，孫曉宇，汪建華，熊向華，張惟材，葛欣

1.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071000；2.軍事科學院 軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100071

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ），化學名稱為4，5-二氫-4，5-二氧化-1-氫吡咯（2，3f）醌-2，7，9-三羧酸，是繼吡啶核苷酸和核黃素核苷酸之后第3種氧化還原型輔酶，能夠刺激線粒體再生，促進神經生長因子生成，具有抗氧化、促進認知、增強體能等功能[1-4]，有人提出應列為B族維生素中的新成員[5]，具有良好的開發前景。

PQQ合成包括化學合成和生物合成，化學合成需要11步反應和5步純化，步驟多、產率低且污染環境；而生物合成步驟少、周期短、成本低，是工業化生產的惟一可行路線。PQQ產生菌均為革蘭陰性菌，其中以甲醇為惟一碳源的甲基營養菌的PQQ產量最高。我們采集了不同地區的土壤樣品，利用甲醇選擇培養基富集培養，通過NBT染色和Native-PAGE法篩選得到1株產量為13.3 mg/L的PQQ產生菌，經鑒定為生絲微菌（Hy?phomicrobium），命名為生絲微菌T28。

1 材料與方法

1.1 材料

甲基營養菌 MP688（Methylovorussp.MP688）由本實驗室保存；瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；DNA聚合酶、DNA marker購自北京全式金生物技術有限公司；山梨糖脫氫酶（SDH）由本實驗室表達純化獲得；測序及PCR引物合成由北京華大基因科技股份有限公司完成；其他生化試劑（分析純）均購自國藥集團。培養基成分見表1～5。

10×非變性緩沖液：Tris amino 30.3 g，甘氨酸144.0 g，pH8.8，定容至1 L。

5×非變性上樣緩沖液：1 mol/L Tris-HCl（pH6.8）12.5 mL，溴酚藍250 mg，甘油25 mL，加水定容至50 mL。

1.2 NBT染色法篩選PQQ產生菌[6]

取5 g土樣于10 mL無菌水中充分振蕩搖勻，靜置后取1 mL懸液加入盛有25 mL富集培養基的三角瓶中，30℃、200 r/min富集培養48 h；移取1 mL培養液至另一盛有新鮮富集培養基的三角瓶中繼續培養，重復富集培養3次；將培養物離心，取 20 μL 上清加 4 μL SDH 和 180 μL NBT檢測液于96孔板，觀察反應液顏色的變化；選擇反應體系變藍紫色陽性孔的菌液，用無菌水稀釋至 1/104～1/108，分別取 10 μL 涂布于平板篩選培養基上30℃培養48～72 h；挑取單菌落于 5 mL HC液體培養基中30℃培養4 d，取1 mL菌液12 000 r/min 離 心 1 min，菌 體用 500 μL 20 mmol/L的Tris-HCl重懸后超聲波裂解；裂解液離心后取20 μL上清于96孔板中，加入4 μL脫輔基的 SDH，30℃溫育20 min后加入180 μL NBT活性染色液，混勻后觀察反應液顏色的變化。

1.3 PQQ產生菌的Native-PAGE法鑒定

PQQ產生菌用HC培養基于30℃培養3 d，取1 mL菌液12 000 r/min離心1 min后棄上清，菌體用500 μL 20 mmol/L Tris-HCl重懸，超聲波裂解，裂解菌液16 μL加4 μL 5×非變性上樣緩沖液制備樣品，進行Native-PAGE。剝離電泳凝膠，放入已加入10 mL蒸餾水、3 mL NBT（2 mg/mL）、3 mL TMB、3 mL PMS（2 mg/mL）、山梨糖少許的90 cm平皿中，37℃避光染色5 min。

1.4 16S rDNA序列擴增與分析[8]

以PQQ產生菌為模板，用16S rDNA通用引物進行PCR，膠回收擴增產物，送北京華大基因科技股份有限公司測序，在NCBI網站進行Blast序列比對分析。

1.5 PQQ產生菌最適培養條件及PQQ產量測定

參考生絲微菌的培養條件[9-10]設計了幾種培養基配方（表1～5），考察了甲醇濃度、pH值等對PQQ產生菌生長和PQQ產量的影響。PQQ產生菌按1% 的接菌量接種于1～6號100 mL液體培養基中，30℃、200 r/min搖床培養，每12 h檢測菌液D660nm值，繪制菌株在各培養基中的生長曲線，確定生絲微菌T28的最適生長培養基。培養1～3 d，用NBT-Gly法[7]測定PQQ產量；第5～6 d測定菌體離心上清液的D400nm和D326nm值，根據公式PQQ=（D326nm-D400nm）×43.376+0.5126計算PQQ產量。

表1 1～4號培養基

表2 1～4號培養基微量元素

表3 5號培養基

表4 5號培養基微量元素

表5 富集培養基（HC培養基）和6號培養基

2 結果

2.1 PQQ產生菌篩選

從不同地區不同環境采集500余個土壤樣品，NBT染色法初篩結果發現15個樣品反應體系變成藍紫色（圖1）。從15個樣品中選擇12個顏色較深的樣品進行復篩，結果如圖2，發現10個樣品的菌體裂解液中含PQQ。

2.2 Native-PAGE鑒定菌株產PQQ

以PQQ標準品為陽性對照，取反應較強的10株菌的菌體裂解液進行Native-PAGE后活性染色，結果如圖3，編號6、7菌株上清中存在大量PQQ，對應的菌株名為T28、T4。

2.3 16S rDNA序列比對鑒定菌屬

以相對PQQ產量較高的T28菌液為模板，采用16S rDNA通用引物進行PCR，擴增產物核酸電泳條帶約1500 bp，與預期相符（圖4）。PCR產物直接測序，序列經NCBI Blast比對分析，表明T28 16S rDNA序列與生絲微菌同源性最高為96% ，因而將該PQQ產生菌命名為生絲微菌T28，繪制系統發育樹如圖5。

圖1 PQQ產生菌初篩結果

圖2 PQQ產生菌復篩結果

圖3 Native-PAGE法定性檢測PQQ

圖4 PQQ產生菌16S rDNA電泳圖

2.4 生絲微菌T28生長最適培養基

考察1～6號培養基對PQQ產生菌生長和PQQ產量的影響，結果如圖6、7。1～4號培養基中菌密度（D660nm值）最終未達到1.3，不是T28最適生長培養基；6號培養基培養144 h時D660nm值達3.57，PQQ產量為2.8 mg/L；5號培養基培養144 h時PQQ產量為13.3 mg/L，且D660nm值最高，為3.93。

圖5 PQQ產生菌經Blast比對結果繪制的系統發育樹

圖6 生絲微菌T28生長曲線

圖7 生絲微菌T28的PQQ產量

3 討論

甲基營養菌在PQQ生產中具有很好的前景，本實驗室曾篩選得到1株PQQ產生菌食甲基桿菌MP688，經工藝優化和遺傳育種PQQ產量超過2000 mg/L。我們還發現該菌的PQQ合成存在多種調控機制，不同甲基營養菌調控機制存在一定差異。為了研究甲基營養菌PQQ合成調控的一般規律，我們進行了新PQQ產生菌株的篩選。

通過甲醇營養培養基富集、NBT染色和Na?tive-PAGE篩選，我們獲得了1株新的PQQ產生菌，經16S rDNA序列鑒定，初步確定該菌為生絲微菌。與文獻報道的生絲微菌相比，該菌生長較緩慢，經過實驗篩選，找到了一種較適宜該菌生長的培養基。我們初步發現該菌PQQ產生條件與本實驗室現有的食甲基桿菌MP688存在明顯差異，這為我們研究PQQ合成調控的共性和特性提供了新的生物材料。