microRNA-193b和microRNA-141在膿毒血癥休克小鼠組織中的表達變化及意義

汪瀟瀟，李雪，李如利，蔣維，3，吳思思

1.重慶大學 附屬腫瘤醫院/重慶市腫瘤研究所/重慶市腫瘤醫院，腫瘤轉移與個體化診治轉化研究重慶市重點實驗室，重慶 400030；2.四川大學 生物治療國家重點實驗室，四川 成都 610041；3.四川大學 華西醫院分子醫學研究中心，四川 成都 610041；4.四川大學 華西醫院公共實驗技術中心，四川 成都 610041

膿毒血癥是由感染或創傷等誘發的劇烈的全身性炎癥反應，并引起組織器官繼發性損傷的臨床全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），進一步發展會出現多器官功能衰竭，危及生命，影響患者預后[1-3]。膿毒血癥的發生機制非常復雜，近年的研究報道認為其與炎癥反應調節失控密切相關，但具體調節機制尚不清楚[4-5]。因此，深入探討膿毒血癥的病理生理學機制，進而開發新的診斷和治療手段是其研究的熱點和難點[5-6]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種非編碼單鏈小分子RNA，長度約為22個核苷酸，存在于真核生物中。miRNA可通過特異性識別并結合其靶mRNA的3′非編碼區，發揮抑制mRNA翻譯或降解靶mRNA的作用，從而抑制靶蛋白質的合成，調節細胞活動[2-3]。研究表明，miRNA在機體的生理過程中發揮重要作用，包括參與生長發育、炎癥反應調節及免疫應答等[7]。microRNA-193b（miR-193b）和 microRNA-141（miR-141）已被證實參與心血管疾病、腫瘤和感染等疾病的調控過程[8-12]，但目前未見二者參與調節膿毒血癥多器官損傷的研究。我們構建了小鼠盲腸結扎穿孔誘導的膿毒血癥模型，觀察miR-193b和miRNA-141的表達變化，探討二者在膿毒血癥休克中的病理生理學意義，為膿毒血癥休克提供新的發病理論基礎及治療策略。

1 材料和方法

1.1 材料

20只8周齡野生型SPF級雄性C57BL/6小鼠購自四川大學實驗動物中心，飼養于潔凈的層流動物房內，溫度、空氣等條件符合標準。

TRIzol試劑、逆轉錄酶抑制劑（Invitrogen）；Bio-Rad iTaq Universal SYBR Green Supermix；Bio-Rad DNAEngine；Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀；HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthe?sis kit（CWBIO）；羅氏COBAS INTEGRA 800全自動生化分析儀。

1.2 引物設計

根據miRNA序列設計引物，檢測miR-141（miRBase Reference Sequence：MIMAT0000432-U AACACUGUCUGGUAAAGAUGG） 和 miR-193b（miRBase Reference Sequence：MIMAT0002819-A ACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU），選擇 U6（NCBI ReferenceSequence：NR_004394.1）作 為 定 量 內參。用莖環法設計以上miRNA逆轉錄引物，U6引物采用Primer 5軟件設計。引物序列見表1，理論上熒光定量PCR擴增產物U6為94 bp，miR-141和miR-193b為34 bp。

1.3 膿毒血癥休克小鼠模型建立[19]

小鼠用2% 戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，將其四肢固定于動物實驗臺，37℃保溫，腹部去毛并消毒；腹部正中切開約1.5 cm，尋找、暴露盲腸；將盲腸輕柔牽出，置于無菌紗布上，用6-0號縫合絲線結扎回盲瓣下方，用19號無菌針頭對結扎部分盲腸進行單孔穿刺，不對穿盲腸；將牽出的盲腸及其內容物復位回腹腔，用4-0號手術縫合線關閉腹壁切口；對照組腹部正中切口并暴露盲腸，但不進行結扎和穿孔；術后，于小鼠背部皮下注射1 mL生理鹽水補液，放回籠中正常飼養。

1.4 小鼠血壓測定及組織樣本處理

表1 引物及序列

納入本研究的小鼠隨機分為對照組（n=10）和模型組（n=10）。采用盲腸結扎穿孔法構建膿毒血癥休克模型后24 h，戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，頸部正中切口約1 cm，鈍性分離并游離頸總動脈，結扎遠心端，近心端切口，頸總動脈插管連接八導生理記錄儀（iWorx公司），分別監測平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（dia?stolic blood pressure，DBP）、心率（heartrate，HR），隨后經腹主動脈取血，血液以肝素抗凝后離心（4000 r/min，4℃）分離血漿，置-70℃保存待測。打開胸腹腔，取心臟、肝臟、肺和小腸組織，用無RNAase的水洗凈后，立即加入TRIzol，剪碎，提取總RNA。

1.5 Real-time PCR檢測組織miR-193b和miR-141的表達

提取對照和休克模型小鼠的心臟、肝臟、肺及小腸組織的總RNA，逆轉錄得到cDNA后，用熒光定量PCR引物進行Real-time PCR。

1.6 統計學處理

所有數據均以x±s表示，采用Prism 5軟件進行統計學分析。2組間的比較采用Unpaired stu?dent′st-test進行統計學分析，組與組之間的差異進一步采用Newman Keulst-test進行統計學分析。P＜0.05為具有統計學差異。

2 結果

2.1 休克小鼠的血壓和心功能指標

在小鼠敗血癥模型實驗中，盲腸結扎穿孔24 h呈休克晚期表現，可見小鼠萎靡、活動明顯減少、毛發無光澤，心率、收縮壓、舒張壓、平均動脈壓、血糖水平與對照小鼠相比分別下降20.9% （P＜0.05）、37.9% （P＜0.05）、25.8% （P＜0.05）、32.9% （P＜0.05）和58.7% （P＜0.01），血乳酸水平則明顯增加355% （P＜0.01）（表2），且動物很快發生多器官衰竭死亡。

表2 對照和休克晚期小鼠的血壓和心功能指標

2.2 膿毒血癥休克時miR-193b在心臟組織的表達下降，在肝臟和肺組織的表達增加

采用Real-time PCR檢測對照組和模型組小鼠心臟、肝臟、肺及小腸組織中miR-193b的表達變化，結果如圖1。與對照組相比，模型組小鼠心臟組織中miR-193b的表達水平下降52.6% （P＜0.05），肝臟和肺組織中miR-193b的表達水平分別增加124.7% 和126.1% （均P＜0.05），小腸組織中miR-193b的表達水平呈增加趨勢，但無統計學差異。

圖1 miR-193b在對照和休克晚期小鼠心臟、肝臟、肺、小腸組織中的表達變化

2.3 膿毒血癥休克時miR-141在肺和小腸組織的表達均增加

采用Real-time PCR檢測對照組和模型組小鼠心臟、肝臟、肺及小腸組織中miR-141的表達變化，結果如圖2。與對照組相比，模型組小鼠肺和小腸組織中miR-141的表達水平分別增加63.4% 和76.5% （均P＜0.05），心臟和肝臟組織中miR-141的表達水平呈增加趨勢，但均無統計學差異。

圖2 miR-141在對照和休克晚期小鼠心臟、肝臟、肺、小腸組織中的表達變化

3 討論

盲腸結扎穿孔誘導動物發生感染性休克的模型被廣泛用于研究膿毒血癥過程中全身多系統、多器官的病理生理學改變。膿毒血癥是嚴重感染產生的一種全身性炎癥反應，進一步可進展為急性呼吸窘迫綜合征、感染性休克和多器官衰竭，其發生發展的重要機制之一是促炎細胞因子和抗炎細胞因子之間的失衡。膿毒血癥發生時，機體釋放促炎性介質，如IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α等[4,13]，引起過度促炎癥反應，進而引起全身炎癥反應綜合征。膿毒癥的發展機制包含多種細胞內及細胞間信號通路如核因子κB（NF-κB）通路、JAK激酶/信號轉導和轉錄激活子（JAK/STAT）通路、絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通路、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K/Akt）通路、膽堿能抗炎通路等及其下游的分子[4]。我們的研究發現，與對照小鼠相比，盲腸結扎穿孔處理的小鼠在術后24 h呈現休克晚期表現，心率和血壓下降，代謝發生紊亂，血糖水平降低，血乳酸水平增加，提示心功能障礙，組織缺血缺氧，以無氧酵解為主。這些研究結果表明，感染性休克晚期出現了以心血管功能障礙和代謝紊亂為特征的多器官損傷[14]。目前，闡明膿毒血癥的病理生理學特征及其發病機制，尋找新的診斷及治療靶點已經成為感染性休克研究的熱點和難點[4,15]。

miRNA通過影響轉錄后水平參與調控多種炎癥因子相關基因、轉錄因子的表達與抑制，各種炎癥因子受體的表達，各種細胞因子及炎性介質的產生、釋放，進而調控膿毒血癥導致的全身失衡的炎癥反應[4,9,15-16]。已有報道表明miRNA可以微調炎癥通路中的多個靶點進而調控炎癥[9]，且已證實多個miRNA參與炎癥的調控[3]。在細菌和病毒刺激時，miR-155均可被激活，調節機體的免疫反應[17]。miR-146a也在膿毒血癥發病過程中發揮著調控免疫和炎癥的重要作用[18]。此外，miR-146a、miR-150和miR-223的表達水平均可在一定程度上反映機體炎癥反應的狀態，可作為膿毒血癥預警、診斷和治療的血清標志物。

miR-193b最初被發現參與腫瘤的轉移調控。炎癥發生時，人體脂肪細胞中過表達miR-193b顯著抑制趨化因子2和TNF-α的表達，進而減少促炎脂肪因子的分泌，促進具有抗炎作用的脂聯素的分泌[14]。miR-141是miRNA-200家族成員，參與不同腫瘤的調節，影響腫瘤細胞增殖、轉移、浸潤。卵巢癌中，miR-141通過P38調節氧化應激。目前尚不清楚miR-193b和miR-141在膿毒血癥中的作用及其調節機制[10]。本研究觀察到膿毒血癥休克晚期時，miR-193b在心臟組織中表達下降，而在肝臟和肺組織中的表達水平增加，提示不同組織的miR-193b對感染性休克的反應性不同，即受miR-193b調節的靶蛋白可能在心臟中表達增加，而在肝臟和肺組織中的表達降低。同時，感染性休克晚期miR-141在肺和小腸組織的表達均增加，提示受miR-141調節的靶蛋白可能在肺和小腸組織中的表達降低。我們的研究表明miR-193b和miR-141的表達水平在感染性休克晚期小鼠的不同受累組織中發生明顯變化，初步證實它們參與膿毒血癥的病理生理調節，其可能的機制是在轉錄后水平調節其下游與炎癥相關的靶蛋白的表達，進而影響各種炎性細胞因子的生成和釋放，從而實現對炎癥反應的調控，但具體機制有待深入探究。我們通過檢測感染性休克晚期小鼠不同受累組織中miR-193b和miR-141的表達水平，觀察到miR-193b在心臟中的表達下降，在肝臟和肺中的表達增加，而miR-141在肺和小腸中的表達均增加。結果提示miR-193b和miR-141可能參與膿毒血癥受累器官的功能調節，是感染性休克防治的潛在新靶點。