miR-19a-3p通過靶向PIK3CB參與調控雌激素受體陽性乳腺癌化療耐藥的相關研究

高潔，李晨曦，趙輝，康歡榮，杜楠

解放軍總醫院第一附屬醫院 腫瘤二科，北京 100048

化學藥物治療（化療）是目前治療惡性腫瘤的主要手段之一[1-2]，而化療耐受是制約臨床腫瘤治療效果的關鍵因素[3]。耐藥機制包括藥物吸收降低或排除增多、藥物靶點改變、細胞修復功能增強等，關鍵基因的突變也可能導致耐藥的發生。microRNA（miRNA）作為高度保守的非編碼RNA，參與一系列重要的生命過程[4]。已有研究表明miRNA參與調控腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[1,5]。

多種化療藥物對乳腺癌有效，但很快會出現耐藥。已有研究證實miRNA的異常可能與乳腺癌耐藥有關[9-10]。miRNA可通過參與藥物轉運和代謝來調控腫瘤耐藥。Chen等發現miRNA-200c過表達可降低靶標基因MDR1的表達和P-糖蛋白的表達，從而增強阿霉素治療的敏感性[11]。miRNA可通過參與調控細胞活動相關的蛋白表達促進腫瘤細胞發生耐藥。Liang等發現上調miR-19可參與乳腺癌細胞對紫杉醇、VP-16等藥物的耐藥，是通過抑制PTEN表達阻止細胞凋亡實現的[12]。miRNA可通過參與上皮間質轉換（epi?thelial-mesenchymal transition，EMT）的發生調控腫瘤耐藥。Cochrane等發現miRNA-200c通過抑制靶基因ZEB1的表達進而抑制E鈣粘蛋白的表達，促進乳腺癌細胞EMT發生，促進腫瘤對順鉑和紫杉醇發生耐藥[13]。以上研究結果表明miRNA與乳腺癌的化療耐藥密切相關，然而其作用機制仍然不清晰，對其進行深入探究或可改善化療耐藥，提高腫瘤治療的藥物敏感度，也一直是乳腺癌化療耐藥的研究熱點。

我們發現雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性乳腺癌順鉑耐藥的細胞株中miR-19a-3p顯著低表達，推測miR-19a-3p在該過程中可能發揮重要作用。本研究探討了miR-19a-3p在ER陽性乳腺癌化療耐藥中的作用及可能的調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

ER陽性乳腺癌順鉑敏感細胞株MCF7-CTRL和耐藥細胞株MCF7-RE為軍事醫學研究院國家生物醫學分析中心免疫學研究室惠贈，正常傳代培養；PIK3CB表達質粒pCMV6-PIK3CB購自北京傲銳東源生物科技有限公司；RPMI1640培養基、胎牛血清（FBS）、胰酶購自Gibco公司；miScriptⅡRT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit購自 QIA?GEN公司；RNA寡核苷酸miRNA類似物和抑制物購自上海吉凱基因化學技術有限公司；轉染試劑LipofectAMINE 2000、總RNA抽提試劑TRIzol購自Invitrogen公司。

1.2 MTT實驗檢測細胞活性

收集處于對數生長期的細胞于96孔板中，每孔接種約5×103細胞，每組設置3個復孔，37℃、5% CO2培養箱中培養24 h，用10 μmol/L順鉑分別處理ER陽性乳腺癌細胞敏感株和耐藥株48 h，之后每孔加入15 μL MTT試劑（5 mg/mL），在培養箱中培養3 h，棄去培養基，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），輕輕振蕩混勻約10 min至結晶充分溶解，用酶標儀測定每孔的D490nm值，進行數據處理。

1.3 細胞總RNA提取

收取轉染48 h后的細胞，用1×PBS緩沖液漂洗3次，加入1 mL TRIzol試劑室溫裂解至細胞裂解液變得透亮；加入200 μL氯仿，劇烈振蕩10 s，室溫靜置 5 min；4℃、12 000 r/min離心 15 min；小心吸取上層水相移至新管，加500 μL異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置30 min；4℃、12 000 r/min離心15 min，管底白色沉淀即為總RNA；棄掉上清，加入1 mL 80% 乙醇，上下顛倒混勻；4℃、10 000 r/min離心15 min；棄上清后室溫晾干，用DEPC水溶解沉淀；取適量RNA樣品稀釋后，用紫外分光光度計測定濃度，讀取D260nm/D280nm值測定純度，電泳鑒定RNA的完整性。

1.4 小RNA文庫（sRNA）構建及測序

用15% 的PAGE膠分離不同大小片段的RNA，回收18～30 nt的片段，在T4RNA連接酶作用下加5′和3′測序接頭將產物反轉錄為雙鏈并擴增，用PAGE膠對PCR擴增產物切膠回收及純化，回收產物溶于EB溶液中，完成文庫建立。用Agi?lent2100 Bioanalyzer和Step One PlusReal-Time PCR System對構建的sRNA文庫進行質量及產量評估，用IllumimaHiSeq 2500測序儀完成sRNA文庫測序。

1.5 測序數據分析IlluminaHiSeq

IlluminaHiSeq 2500測序得到長度為49 nt的序列，通過數據處理去除3′端缺失、5′端污染、插入片段缺失、含polyA等序列后獲得高質量的clean reads。對clean reads的長度、質量和分布等進行統計、分類和注釋；通過bowtie將sRNA定位到基因組，分析reads在基因組上的分布及表達情況；用bowtie將reads與miRBase數據庫進行比對，注釋已知miRNAs；通過bowtie將sRNA和Gen?Bank、Rfam數據庫比對，注釋除miRNA以外的sRNA。

1.6 差異表達miRNA分析

篩選乳腺癌耐藥細胞株和敏感株的文庫差異表達miRNA，將2個文庫中的miRNA歸一化處理后進行倍數變化值（fold change）和P值統計計算。篩選顯著性差異表達miRNA的具體標準為：①reads數大于 10；②∣log2（fold change）∣＞1；③P＜0.05。

1.7 實時熒光定量PCR

用miScript SYBR Green PCR Kit檢測試劑盒分析miRNA的相對含量。按說明書步驟，采用2 μg總RNA進行反轉錄，qPCR檢測。U6作為內參，通過CT（2-ΔΔCt）方法分析miRNA的相對含量。

1.8 miRNA類似物/抑制物及質粒轉染

每孔取20 pmol miRNA類似物/抑制物，稀釋于250 μL無血清1640培養基中；按照樣品與轉染試劑為1∶3的比例將LipofectAMINE 2000轉染試劑稀釋于250 μL無血清1640培養基中，輕彈混勻，室溫靜置5 min后加入載體稀釋物中，輕彈混勻，室溫靜置20 min；將樣品-轉染試劑混合物逐滴加入細胞培養板中，同時設置對照組，轉染后48 h提取總RNA。質粒轉染操作類似，用量為1 μg/孔（24孔板）。

1.9 Starbase數據調取

選擇Starbase v2.0數據庫（http://starbase.sysu.edu.cn/）中 miRNA-target interaction 板塊 miRNA-mRNA模塊，分析miR-19a-3p的靶基因。

1.10 統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據處理，計量資料用x±s表示，組間數據比較采用t檢驗分析和方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 順鉑處理對ER陽性乳腺癌細胞活性的影響

10 μmol/L順鉑處理ER陽性乳腺癌耐藥細胞株和敏感株MCF7，MTT檢測細胞活性，結果如圖1所示，耐藥株的細胞數量隨著處理時間的增加與敏感株相比逐漸增多（P＜0.001）。結果說明乳腺癌耐藥細胞株對順鉑處理不敏感。

圖1 順鉑處理對ER陽性乳腺癌細胞活性的影響

2.2 篩選差異表達miRNA

RNA測序篩選ER陽性乳腺癌耐藥細胞株和敏感株差異表達的miRNA（圖2），發現miR-19a-3p在耐藥株MCF7-CTRL和敏感株MCF7-RE中的表達差異最大，在耐藥株MCF7-RE中呈低表達。

圖2 RNA測序篩選差異表達基因

2.3 ER陽性乳腺癌耐藥細胞株和敏感株miR-19a-3p的表達

實時熒光定量PCR檢測ER陽性乳腺癌耐藥株MCF7-RE和敏感株MCF7-CTRL中miR-19a-3p的含量，結果見圖3，miR-19a-3p在耐藥細胞株中的含量遠低于敏感株（**P＜0.01）。該結果進一步驗證了RNA測序的篩選結果。

圖3 miR-19a-3p在ER陽性乳腺癌耐藥細胞株和敏感株中的表達量

2.4 miR-19a-3p過表達降低ER陽性乳腺癌耐藥株化療耐藥

合成miR-19a-3p類似物和抑制物，分別轉染MCF7-RE和MCF7-CTRL（圖4A）。miR-19a-3p過表達可比較明顯地降低乳腺癌耐藥細胞株的耐藥濃度，增加對順鉑藥物的敏感度；同時，在敏感株中抑制miR-19a-3p的表達也反過來增加了敏感細胞株的藥物作用濃度（圖4B，P＜0.01）。該結果提示，miR-19a-3p負調控ER陽性乳腺癌細胞順鉑耐藥。

圖4 miR-19a-3p影響ER陽性乳腺癌細胞的耐藥藥物濃度

2.5 miR-19a-3p負調控PIK3CB參與乳腺癌化療耐藥

我們對miR-19a-3p參與調控乳腺癌細胞順鉑敏感的作用機制進行了初步研究。通過Star?basev 2.0分析發現，在229例乳腺癌樣本中，癌基因PIK3CB（PI3K）是miR-19a-3p調控的靶標基因，并且呈負相關（圖5A，r=-0.125 75）。PIK3CB是PI3K/Akt信號通路的重要組成成分之一，在腫瘤形成和發展過程中發揮重要作用，如抑制細胞凋亡、促進細胞增殖等。分別轉染miR-19a-3p類似物和抑制物，通過實時熒光定量PCR和Western印跡分別在RNA和蛋白表達水平進行了驗證，結果顯示miR-19a-3p能夠負調控PIK3CB（圖5B）。在乳腺癌耐藥細胞株中，轉染miR-19a-3p能夠明顯降低細胞的耐藥性，抑制其增殖；如果同時轉染PIK3CB表達質粒進行回復實驗，會部分減弱miR-19a-3p耐藥抑制的效應（圖6）。

圖5 miR-19a-3p在乳腺癌細胞中靶向調控癌基因PIK3CB

圖6 miR-19a-3p負調控癌基因PIK3CB參與乳腺癌細胞化療耐藥

3 討論

目前乳腺癌的治療方式是以手術、內分泌治療[6]、化療和靶向治療等多種手段結合的綜合治療[1]。研究表明，約70% 的乳腺癌患者會出現化療耐藥或在接受治療后很快出現化療耐藥[7-8]。無論是初始耐藥還是獲得性耐藥，都會影響乳腺癌患者的生活狀態和生存時間。

然而截至目前化療耐藥的機制并不十分清楚。大量研究表明，miRNA在腫瘤發生發展中可通過多種途徑發揮促癌或抑癌作用，這其中一些病理、生理過程與腫瘤化療耐藥密切相關，可見miRNA也參與腫瘤化療耐藥的發生[2]。

我們通過RNA測序發現，在化療耐藥的ER陽性乳腺癌細胞耐藥株和敏感株中，miR-19a-3p的含量差異顯著。通過qPCR對ER陽性乳腺癌耐藥株和敏感株進行檢測，證實miR-19a-3p在耐藥株中低表達。進而初步分析miR-19a-3p負調控乳腺癌化療耐藥的機制，通過Starbase v2.0調取TCGA數據庫中miR-19a-3p的相關數據，預測癌基因PIK3CB是miR-19a-3p的靶標基因并呈負相關，后續我們證明miR-19a-3p的確能夠靶向PIK3CB并與乳腺癌細胞的順鉑耐藥相關。在回復實驗過程中，過表達PIK3CB能夠部分抵消miR-19a-3p的耐藥抑制性，一方面說明miR-19a-3b/PIK3CB調控耐藥性的通路的確存在，另一方面說明存在miR-19a-3p靶向其他潛在靶標參與耐藥調控的可能性。由于miRNA作用靶標眾多，具有多能性，我們后續的工作須擴大篩選范圍，盡可能探索與描繪miR-19a-3p在乳腺癌中的功能性調控網絡，而不是局限于對PIK3CB的調控研究，這將有助于深入解析miR-19a-3p調控ER陽性乳腺癌化療耐藥的機制，為臨床預防或治療ER陽性乳腺癌提供新的靶點。