血清C反應(yīng)蛋白、Beclin1及25羥維生素D水平聯(lián)合檢測(cè)對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎病情活動(dòng)性判斷價(jià)值的研究

李 琰，慕珂珂，董炎紅，蔣曉欽

(中國(guó)人民解放軍第一五三中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450007)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是臨床常見(jiàn)慢性腸道疾病，近年來(lái)發(fā)病率明顯上升[1]。目前認(rèn)為UC發(fā)病與遺傳、免疫、環(huán)境、感染及心理應(yīng)激等多因素有關(guān)[2]。且近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸黏膜炎癥反應(yīng)可誘發(fā)自身免疫異常，造成級(jí)聯(lián)性免疫反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致炎癥持續(xù)反復(fù)發(fā)作[3]。而腸道黏膜免疫細(xì)胞對(duì)病原微生物清除主要通過(guò)吞噬與自噬兩種途徑，前者系殺滅細(xì)胞內(nèi)微生物的細(xì)胞防御機(jī)制，由TLR-LC3/beclin1介導(dǎo)，巨噬細(xì)胞吞噬微粒并活化TLR，促進(jìn)自噬體分子LC3聚集至吞噬體，促進(jìn)吞噬體與自噬體融合，引起快速酸性化反應(yīng)，殺滅吞噬外源物[3]。其中Beclin為人類特異性自噬相關(guān)基因，其可與PI3K結(jié)合形成復(fù)合物，作用于ATG自噬基因，調(diào)節(jié)自噬活性[4]。但對(duì)其在UC發(fā)病中的確切機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。C反應(yīng)蛋白(CRP)則為與組織損傷及炎癥相關(guān)性的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)有較高的敏感度，常用于UC輔助診斷中。25羥維生素D[25(OH)D]則為維生素D在體內(nèi)存在的關(guān)鍵形式，不僅參與鈣磷代謝，同樣對(duì)感染、機(jī)體免疫存在一定的調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)大部分炎癥性常伴患者均存在維生素D缺乏表現(xiàn)[5]。本文探討血清CRP、Beclin1、25(OH)D聯(lián)合檢測(cè)對(duì)UC病情活動(dòng)性評(píng)估的臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料2015年1月至2017年10月我院收治的100例UC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡>18歲；均經(jīng)結(jié)腸鏡確診為UC；臨床表現(xiàn)為持續(xù)、反復(fù)發(fā)作腹瀉，伴腹痛，里急后重，黏液凝血；結(jié)腸鏡下見(jiàn)黏膜血管紋理模糊或紊亂、充血、水腫，見(jiàn)膿性分泌物附著，病變處見(jiàn)明顯多發(fā)性潰瘍或彌漫性糜爛；病情分級(jí)參照Truelove-wiffs內(nèi)鏡下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，分為緩解期、活動(dòng)期(Ⅰ～Ⅲ級(jí))；患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重心肝腎肺疾病者；合并類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡者；感染性、寄生蟲(chóng)性、放射性、缺血性自身結(jié)腸炎者；合并嚴(yán)重精神疾病者；既往有腸道切除史者；有非甾體類抗炎藥物及質(zhì)子泵抑制劑長(zhǎng)期應(yīng)用史者；乙醇成癮者；合并內(nèi)分泌及代謝性疾病者；妊娠及哺乳期女性。其中男59例，女41例；年齡20～76歲[(49.5±10.7)歲]；居住地：城鎮(zhèn)67例，農(nóng)村33例；其中緩解期28例，活動(dòng)期72例(Ⅰ級(jí)26例，Ⅱ級(jí)34例，Ⅲ級(jí)12例)。

1.2Truelovee-wiffs內(nèi)鏡下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[6]Ⅰ級(jí)：內(nèi)鏡下檢查見(jiàn)接觸性出血、水腫、黏液附著；Ⅱ級(jí)：鏡下見(jiàn)黏膜脆性增加，伴點(diǎn)狀出血、顆粒樣改變，有黃色或綠色膿液，擦拭見(jiàn)潰瘍；Ⅲ級(jí)：鏡下見(jiàn)明顯黏膜水腫，有膿血性滲出，潰瘍大片融合，見(jiàn)血性滲出物。

1.3主要儀器與試劑微量高速離心機(jī)-TG16 W(北京永光明醫(yī)療儀器廠)，紫外分光光度計(jì)(上海圣科設(shè)備有限公司)，酶標(biāo)儀(芬蘭Lab systems Multiskan MS公司，450 nm)，Cobas 6000型全自動(dòng)生化免疫分析儀(羅氏公司)；Beclin 酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒、鼠抗人Beclin1單克隆抗體、辣根酶標(biāo)記羊抗兔/小鼠二抗試劑盒(美國(guó)Santa Cruz公司)，引物設(shè)計(jì)及合成(上海Sangon Biotech公司)，CRP檢測(cè)試劑盒(福州邁新生物科技有限公司)。

1.4方法所有患者入院后均采集空腹肘靜脈血3 ml，3000 r/min離心5 min，分離血清，采用全自動(dòng)生化免疫分析儀，應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定外周血25(OH)D水平，嚴(yán)格按照試劑使用說(shuō)明進(jìn)行操作；采用免疫比濁法測(cè)定血清CRP水平；采用ELISA法測(cè)定血清Beclin1水平，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔、空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi)加0.75～12 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品50 μl，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體50 μl；待測(cè)樣品孔加入待測(cè)樣本10 μl+稀釋液40 μl+辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體50 μl，封孔，室溫孵育1 h，加洗滌液，靜置60 s，棄洗滌液，清除水分，洗板6次，加入底物，37 ℃避光孵育15 min，加入終止液，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定450 nm波長(zhǎng)各孔吸光度(OD)值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，并繪制各指標(biāo)反應(yīng)疾病活動(dòng)性的ROC曲線，計(jì)算Youden指數(shù)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同病情活動(dòng)性UC患者血清CRP、Beclin1、25(OH)D水平比較活動(dòng)期UC患者血清CRP、Beclin1水平均高于緩解期，25(OH)D低于緩解期，其中Ⅱ～Ⅲ級(jí)患者CRP、Beclin1高于Ⅰ級(jí)，25(OH)D低于Ⅰ級(jí)，Ⅲ級(jí)患者血清CRP、Beclin1水平高于Ⅱ級(jí)，25(OH)D水平低于Ⅱ級(jí)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同病情活動(dòng)性UC患者血清CRP、Beclin1、25(OH)D水平比較

2.2血清各指標(biāo)與UC疾病活動(dòng)性相關(guān)性分析CRP、Beclin1表達(dá)與UC緩解期無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，CRP、Beclin1與UC活動(dòng)期內(nèi)鏡下分級(jí)呈正相關(guān)，25(OH)D與UC活動(dòng)期內(nèi)鏡下分級(jí)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 血清各指標(biāo)與UC疾病活動(dòng)性相關(guān)性分析

2.3血清各指標(biāo)對(duì)UC活動(dòng)期診斷ROC分析當(dāng)CRP為3.02 mg/L，Beclin1為2.00 ng/ml，25(OH)D為20 ng/ml時(shí)，以Beclin1診斷UC活動(dòng)期敏感度最高，其次為CRP，但三者聯(lián)合診斷敏感度、特異度及Youden指數(shù)最高，見(jiàn)表3。ROC曲線圖見(jiàn)圖1。

表3 血清各指標(biāo)對(duì)UC活動(dòng)期診斷ROC分析

圖1 各指標(biāo)診斷UC活動(dòng)期ROC曲線

3 討論

UC屬慢性非特異性炎癥性疾病，發(fā)生于直、結(jié)腸，表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、里急后重、黏液膿血便等特點(diǎn)，其疾病活動(dòng)期癥狀表現(xiàn)與急性時(shí)相性反應(yīng)類似，可伴明顯白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血沉、血小板計(jì)數(shù)等水平發(fā)生改變，但作為臨床診斷診斷敏感度及特異度均較低，無(wú)法動(dòng)態(tài)反映UC患者腸道炎癥活動(dòng)狀態(tài)[7]。目前臨床用于評(píng)估UC病情方式主要為內(nèi)鏡檢查及結(jié)腸鏡檢查，兩者均有入侵性，患者耐受性差，痛苦大，可接受度低[8]。而尋求準(zhǔn)確、快捷且無(wú)創(chuàng)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)評(píng)估UC病情已成為臨床研究者關(guān)注的重點(diǎn)課題。

CRP為重要炎癥標(biāo)志物，屬機(jī)體炎癥反應(yīng)血清高敏感度標(biāo)志物，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥或損傷時(shí)，巨噬細(xì)胞釋放大量炎癥遞質(zhì)，刺激肝臟合成無(wú)活性維生素K依賴性蛋白，與凝血酶結(jié)合轉(zhuǎn)化為活化CRP，強(qiáng)化吞噬細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)可增加單核細(xì)胞表面組織因子表達(dá)，放大免疫效應(yīng)，加重組織損傷[9]。早期研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性疾病及惡性腫瘤患者均伴血清CRP水平明顯上調(diào)[10]。也有學(xué)者[11]指出大部分UC患者均伴高CRP水平。本研究發(fā)現(xiàn)，UC活動(dòng)期患者CRP水平明顯高于UC緩解期，且隨活動(dòng)期患者病情的進(jìn)展，CRP水平逐漸上升，與Schoepfer等[12]研究結(jié)論相符。同時(shí)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CRP與UC患者活動(dòng)性呈正相關(guān)，提示CRP可能參與UC病情進(jìn)展。

25(OH)D為體內(nèi)維生素D的表現(xiàn)形式，屬具生物活性脂溶性類固醇衍生物，可與維生素D受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，調(diào)節(jié)鈣磷代謝，在維持骨骼、牙齒正常發(fā)育中有重要作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，維生素D及其受體在拮抗細(xì)菌感染及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫中均有其作用[13]。楊劍等[14]表示，維生素D為炎癥性腸病關(guān)鍵的環(huán)境因子，可調(diào)節(jié)機(jī)體適應(yīng)性免疫反應(yīng)，抑制淋巴細(xì)胞增殖，下調(diào)免疫應(yīng)答反應(yīng)。托靜美等[15]發(fā)現(xiàn)，有超過(guò)50%的炎性腸病患者均伴維生素D缺乏。本研究發(fā)現(xiàn)，UC活動(dòng)期患者25(OH)D水平較緩解期明顯降低，且隨病情嚴(yán)重程度的提升，25(OH)D水平逐漸降低，且相關(guān)性分析顯示，25(OH)D水平與UC疾病活動(dòng)性呈負(fù)相關(guān)，提示25(OH)D缺乏可能在UC疾病活動(dòng)及進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

Beclin1則為與自噬相關(guān)特異性基因，可抑制細(xì)胞周期增殖、腫瘤新生血管生成及機(jī)體炎癥反應(yīng)，可通過(guò)調(diào)節(jié)其他自噬基因蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中的定位來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體自噬活性，其表達(dá)上調(diào)提示機(jī)體自噬水平強(qiáng)化。熊真[16]發(fā)現(xiàn)，在正常黏膜組織中，Beclin1表達(dá)極低，而病理及應(yīng)激狀態(tài)可刺激Beclin1表達(dá)，且隨著病情加重，Beclin1表達(dá)上升。也有研究者發(fā)現(xiàn)，自噬蛋白過(guò)度表達(dá)提示機(jī)體炎癥反應(yīng)強(qiáng)化，可作為炎癥性腸病診斷的依據(jù)[17，18]。本研究對(duì)UC患者血清Beclin1水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，UC患者血Beclin1處于高水平，且活動(dòng)期患者血Beclin1水平明顯高于緩解期，同時(shí)隨UC活動(dòng)性提升，Beclin1水平逐漸上調(diào)，分析可能原因?yàn)锽eclin1過(guò)度自噬可能引起結(jié)腸炎癥，增加病原菌感染風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致自身免疫功能異常，誘導(dǎo)缺氧缺血性應(yīng)激反應(yīng)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，CRP、25(OH)D、Beclin1三者均對(duì)UC活動(dòng)期診斷有較高的敏感度，但前兩者特異度較低，單項(xiàng)檢測(cè)中以Beclin1綜合價(jià)值最高，但三者聯(lián)合診斷可提高UC活動(dòng)期診斷的敏感度、特異度均較高，可彌補(bǔ)單項(xiàng)診斷的缺陷。