人釉成熟蛋白誘導下的釉質原位晶體生長

張 鵬，馮小云，杜 芹，，田 鯤，

(1.遵義醫學院，貴州 遵義 563000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院口腔科，四川 成都 610072)

牙體缺損是口腔常見疾病之一，可能會影響到咬合功能、鄰接關系等，若缺損層次深在，甚至會影響牙髓、牙周組織健康，妨礙生長發育、面部美觀[1]。目前臨床治療牙體缺損的方法主旨是運用形/質相近的材料(金屬、樹脂、玻璃離子、陶瓷等)進行充填，但材料始終存在密合度不高、易出現微滲漏引發繼發齲等問題。研究表明，流動樹脂和玻璃離子充填齦下齲成功率分別為91.9% 、75.8%[2]。牙釉質羥基磷灰石的形成和生長都受組織中相關蛋白調控，釉基質蛋白為蛋白混合物，能有效誘導釉質定向礦化[3，4]，近年來，研究者發現可以利用有機大分子為模板引導牙體組織礦化實現微量組織修復，如釉原蛋白在疏水作用下自組裝成納米球，緊密圍繞在微晶周圍形成串珠樣結構[5]，這是羥基磷灰石晶體結構的基礎[6]，決定了之后羥基磷灰石晶體的生長取向和形態[7～9]。據研究表明，釉成熟蛋白可能參與了釉質發育初始階段礦化晶核的形成[12]。本實驗旨在研究釉成熟蛋白對釉質晶體生長的誘導和調控能力。

1 材料與方法

1.1材料本實驗采用2014年8月正畸兒童預防性拔出的第三恒磨牙牙胚2個(圖1)，由四川省醫學科學院·四川省人民醫院口腔科提供，經四川省醫學科學院·四川省人民醫院倫理委員會批準，全部調查和取樣均征得受試者及其監護人同意并簽署知情同意書。

圖1 正畸兒童曲面體層片(箭頭示第三恒磨牙)

1.2方法

1.2.1成熟蛋白的獲取方法 從上述牙囊中提取牙胚細胞總RNA，反轉錄、擴增得到釉成熟蛋白cDNA。使用限制性內切酶剪切得到釉成熟蛋白全長基因，將其與pMD18-T載體相連構建質粒，以大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞表達得到釉成熟蛋白。

1.2.2牙片的制備 將收集的新鮮離體牙(牙冠完整、無破損)用低速手機在生理鹽水沖洗冷卻下切割、打磨制備為直徑約10 mm，厚約1 mm左右的牙片，依次用800、1000、1200、1500、2000目的砂紙打磨，37%磷酸酸蝕1 min(余留少許牙片不酸蝕)，去污劑、丙酮、無水乙醇和去離子水分別超聲清洗10 min，干燥備用。

1.2.3釉成熟蛋白溶液配制 在冰上用50 mMTris-HCl(pH=7.6)將2 mg/ml的釉成熟蛋白儲存液稀釋至100 μg/ml，與此同時，釉成熟蛋白液的PH值也由3.5變為7.6，然后再室溫孵育以備用。

1.2.4礦化液配制 礦化液由3.0 mM CaCl2、180 mMNaCl、1.5 mMKH2PO4、50 mMTris-HCl(pH=7.6)配制而成[10]，0.1 MHC1和0.1 MNaOH調節溶液的PH值至7.6。礦化液配制完成后需立即使用。

1.2.5釉成熟蛋白誘導礦化 本實驗采用玻片及上述牙片作為樣本，按處理方法分為5組(表1)：組1為玻片，依次用去污劑、丙酮、無水乙醇和去離子水分別超聲清洗10 min，干燥備用；組2為牙片，僅切割后用砂紙打磨后用去污劑、丙酮、無水乙醇和去離子水分別超聲清洗10 min，干燥備用(未酸蝕)；組3～5為牙片，切割、砂紙打磨、37%磷酸酸蝕1 min后用去污劑、丙酮、無水乙醇和去離子水分別超聲清洗10 min，干燥備用。組1、5為實驗組，用于觀察有無釉成熟蛋白引導礦化、以及釉成熟蛋白在牙片上與玻片上引導礦化的區別，組2、3、4為對照組，用于觀察正常釉質結構及無釉成熟蛋白引導的礦化產物。

表1 實驗分組及試劑

將組1的玻片和組5的牙片先置于1 ml釉成熟蛋白液中室溫孵育30 min，再轉移至10 ml新鮮配制的礦化液中，密封后置于37 ℃恒溫箱中培養孵育，每24 h更換一次礦化液(新鮮配制)，每天取樣觀察，以評估時間與釉成熟蛋白引導礦化的關系；組4的牙片直接放置于10 ml新鮮配制的礦化液中，密封后置于37 ℃恒溫箱中培養孵育，每24 h更換一次礦化液(新鮮配制)兩周后取出樣本；組2、3超聲清洗干燥后不做任何處理。將各組樣本通過導電膠固定在試樣品臺上，噴金60 s后，放入掃描電鏡真空室進行觀察。

2 結果

在光滑玻片上，釉成熟蛋白能誘導能形成“串珠樣”結構，并交織成網狀，但所形成的產物只是沿著玻片表面生長，且平均粒徑較小(圖2a)。圖2b為僅打磨、超聲清洗后牙片，可見正常釉柱結構，甚至可透過裂紋看見羥基磷灰石纖維。正常牙齒酸蝕后經掃描電鏡觀察可見釉柱頭尾相接所形成的“網拍狀”結構(圖2c)。將牙片浸泡在單純的礦化液中并37 ℃恒溫孵育14天，在牙片的表面形成了一層形狀不規則的片狀礦化產物(圖2d、e、f)，礦化產物呈平面型，雜亂無章地覆蓋在釉質表面，未見平行于釉柱c軸的立體結構。將牙片浸泡在釉成熟蛋白和礦化液中37 ℃恒溫培養箱中孵育3天可見“網拍狀”的釉質結構表面生長出了“串珠樣”的礦化產物，并沿著釉柱c軸呈立體結構，平均粒徑較小，且產物稀疏(圖2g)；14天可見“網拍狀”的表面已被礦化產物填補起來，在縫隙處可見“串珠樣”產物的粒徑增大、長度增加(圖2h、i)，相對于第3天更加密集。

在未添加釉成熟蛋白的對照組中，組4相比于組2、組3，能形成再礦化產物，但羥基磷灰石微晶尚且不能形成，所以礦化產物呈平面型，雜亂無章地覆蓋在釉質表面，未見平行于釉柱c軸的立體結構。而組1，即使在光滑玻片上，也能形成“串珠樣”結構，并交織成網狀，但所形成的產物只是沿著玻片表面生長，且平均粒徑相對于第5組礦化產物較小。而比較組5與組4，釉成熟蛋白能誘導形成沿釉柱c軸的礦化產物，可能為羥基磷灰石微晶，且粒徑、長度、密度都隨時間的增加而增長，符合粒徑長大的物理機制。

圖2 掃描電子顯微鏡形貌表征：a：組1，添加釉成熟蛋白的玻片礦化14天；b：組2，正常釉柱結構；c：組3，酸蝕后釉柱結構；d、e、f：組4，無釉成熟蛋白引導的礦化；g、h、i：組5，釉成熟蛋白引導的礦化

3 討論

牙釉質由六方形的羥基磷灰石晶體構成，且這些晶體具有平行于釉質c軸的擇優取向，這是釉質的一級結構；羥基磷灰石晶體再礦化形成納米級纖維，構成釉質的二級結構；互相平行的納米纖維聚集形成微纖維，組成三級結構；微纖維沿長軸(c軸)平行排列，進一步組裝構成更粗的纖維束，這是釉質的四級結構；釉柱的第五級分級結構是釉柱和釉柱間質，這是釉質的主要承力結構；釉柱和間質是由兩種不同取向的纖維束組裝而成，二者互成一定角度，在釉質表面 1 /3層內，釉柱以放射狀方式排列，在內 2 /3層則以交叉方式排列；這些排列結構是釉質的第六級結構；釉質以不同的排列方式，最后覆蓋整個牙冠，形成釉質的七級結構[14]。見圖3。

圖3 人牙釉質的七級分級結構示意圖[11]

圖4 羥基磷灰石結構示意圖[12] a：立體結構，b：平面結構

沿羥基磷灰石c軸自上而下投影可見晶胞中央為OH-，周圍為6個Ca2+，分為兩層，形成兩個平行的三角形，a1=a2=0.9432 nm，a軸互成120度夾角，c軸與a軸垂直[12](圖4)。所以要想模擬正常釉質結構進行礦化必須模擬羥基磷灰石的排列以及釉柱與間質的結構。在釉質的發育過程中，由釉原蛋白自組裝形成帶負電荷的納米小球，引導牙釉質成核和定向生長，逐級形成釉質結構；在釉質成熟之前，帶負電的納米小球與羥基磷灰石晶面相互作用，防止晶體聚合；在進一步的生長過程中，釉基質蛋白降解為小分子蛋白控制釉質的生長和取向[13，14]，具體作用為帶有負性電荷的釉基質蛋白納米微球通過靜電作用吸附在與羥基磷灰石c軸平行的晶體表面，暫時封閉b、c面，穩定羥基磷灰石晶體，使羥基磷灰石微晶沿裸露的羥基磷灰石晶體c軸擇優性生長[12，15]。研究發現[16]，在四種釉基質基因中，釉成熟蛋白基因是唯一在蜥蜴與小鼠的釉質發育過程中于結構和表達模式中顯示出明顯差異的基因，由于釉基質蛋白在釉質結構及其礦化中所起的重要作用，所以該研究認為釉成熟蛋白基因的結構和表達的變化可能與從非哺乳動物的非晶體釉質結構到哺乳動物的晶體釉質結構有關。釉成熟蛋白作為釉基質蛋白中的一種，含磷酸鈣結合位點，能促進磷酸鈣礦化，且據研究表明，在小鼠牙胚發育過程釉成熟蛋白的時空表達研究中，成釉蛋白可能參與了釉質發育初始階段礦化晶核的形成[17]。成釉蛋白誘導進行礦化所形成的產物最初為納米小球，隨著時間變長，納米小球慢慢形成串珠樣結構且平行與釉柱的c軸。時間越長，串珠樣結構的長度越長、粒徑越大。這種結構被認為是形成平行排列羥基磷灰石晶體的分子基礎[7～9]，即羥基磷灰石微晶。在玻片上，釉成熟蛋白誘導礦化也能形成串珠樣結構的產物，但并不能垂直于玻片平面生長，粒徑小，僅能覆蓋在玻片表層(圖2a)，在無釉成熟蛋白誘導的礦化中，礦化產物僅能堆積在牙片表面，不能形成立體結構(圖2d、e、f)。而在牙片上(圖2h、i)串珠樣結構卻能平行于釉柱c軸、垂直于牙片平面生長，可能由于釉成熟蛋白帶負性電荷，通過靜電作用吸附在與羥基磷灰石c軸平行的晶體表面，然后納米微球組裝成較大的微球，與b、c晶面發生靜電相互作用，從而暫時封閉b、c面，穩定羥基磷灰石晶體，使羥基磷灰石微晶沿裸露的羥基磷灰石晶體表面繼續生長[10，11]，相互平行的串珠棒狀晶體模擬了平行排列的釉柱，特征串珠結構證實釉成熟蛋白在釉質生長過程中的重要作用。

釉成熟蛋白能誘導形成平行于釉柱c軸、垂直于牙片平面的串珠棒狀晶體產物，說明釉成熟蛋白在釉質發育過程中起著引導羥基磷灰石晶體沿著釉柱c軸擇優性生長的重要作用。

本實驗所形成的礦化產物的量比較少，并且尚未測量其硬度，無法評估其強度，且實驗周期短，尚不能知曉長期鈣化產物的結構及方向。望在后續實驗中能延長礦化實驗時間，且采用合適的方法評估其硬度、強度，以便今后有希望能將生物再礦化的方式用于牙體缺損的修復。