離體頸動脈竇-竇神經標本灌流與記錄一體化裝置的制備

劉 萍 辛 方 張思韜 黃海霞 王 偉 趙海燕

(1.首都醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系，北京 100069；2. 首都醫科大學燕京醫學院機能教研室，北京 101300)

動脈竇壓力感受器是減壓反射的第一個環節，主要作用是將血壓變化時對血管的牽張刺激轉變為可向中樞傳導的電信號，即機-電換能作用[1]。然而頸動脈竇壓力感受器的機電換能作用的諸多細節并不清楚。目前器官水平研究動脈壓力感受器功能的方法有兩種：一種是在體隔離灌流的方法，實驗時隔離頸動脈竇，鉗制頸動脈竇內壓力，同時記錄動脈血壓變化，進而測定出壓力感受器的功能曲線[2]，另一種方法則是采用離體制備頸動脈竇-竇神經標本，直接觀察頸動脈竇內壓力變化對竇神經放電的影響[3]。相對于前一種在體隔離灌流的方法，后一種方法由于減少了其他神經體液因素對血壓的影響，實驗結果更能反映壓力感受器本身的功能。本課題組經過多年的摸索，研制了一套離體頸動脈竇-竇神經標本灌流與記錄一體化裝置，實現了對離體頸動脈竇-竇神經標本血管內外灌流的同時控制竇內壓力并同步記錄竇神經放電。

1 材料與方法

1.1 離體頸動脈竇-竇神經標本的制備

實驗采用成年家兔，體質量1.9～2.7 kg，雌雄不拘。20%(質量分數)氨基甲酸乙酯(5 mL/kg)靜脈麻醉，安置氣管插管。游離頸動脈竇區域和竇神經，最后取出的頸動脈竇-竇神經(carotid sinus-sinus nerve， CS-SN)標本，包括頸總動脈(長約7 mm)、頸外動脈(長約5 mm)、頸內動脈(長約5 mm，結扎)和竇神經(長約7 mm)。

1.2 標本槽的制備與標本的固定

利用有機玻璃板自制標本槽(圖1)，標本槽包括血管槽(圖1a)和神經槽(圖1b)兩部分，整個標本槽被固定在保溫盒中。神經槽和血管槽之間被一塊有機玻璃板(圖1j，厚0.5 mm)分隔開，隔板上有一窄縫(圖1k，寬0.5 mm)，為兩槽間唯一相通的部位。血管槽內兩側各預置1根不銹鋼插管(外徑1.5 mm)， 分別與標本的頸總動脈端(圖1n)和頸外動脈端連接(圖1o)，由電氣比例調節閥推動的灌流液，經一側不銹鋼插管進入頸總動脈到達頸動脈竇區和頸外動脈，再經另一側不銹鋼插管流出，此為血管內(竇內)灌流的途徑。標本浸泡在血管槽內流動的生理溶液中，血管槽另有該液體的入口(圖1e)和出口(圖1f)，提供血管外灌流渠道。血管槽底部靠近隔板窄縫處(圖1k)，置有一不銹鋼絲電極(圖1 m)，作為記錄竇神經放電的參考電極。CS-SN標本的竇神經部分(圖1g)經神經槽和血管槽間隔板的窄縫(圖1k)進入神經槽。窄縫由硅酯密封，以隔絕兩槽間液體的流動。在神經槽底部靠近窄縫(圖1k)2 mm處，安置一個有機玻璃小立柱(圖1i，直徑1.5 mm，高2 mm)。一根不銹鋼絲(直徑0.1 mm，長20 mm)從神經槽底部向上穿過底板，并從小立柱中心穿出，不銹鋼絲裸露部分長6 mm，懸于神經槽內，作為記錄電極(圖1h)。不銹鋼絲另一端從神經槽底板下引出，與放大器輸入端連接。神經槽內充石蠟油，覆蓋竇神經。

1.3 灌流液、灌流方式及竇內壓控制

灌流液成分： NaCl 154 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl22.2 mmol/L，MgCl21.1 mmol/L，葡萄糖5.5 mmol/L；以HEPES-NaOH(5 mmol/L)調節pH值為7.4，持續以100% O2平衡，灌流液溫度控制在 36～37 ℃。

實驗時，同時對標本分別進行竇內和竇外灌流，兩條途徑灌流液相同。一路對標本表面(竇外)以 1 mL/min勻速灌流(圖1f)，血管槽液體表面覆蓋石蠟油；另一路則由壓力調節閥輸出的氣壓推動灌流液對竇內(血管內)進行脈動式灌流，該路灌流壓由灌流液入口處的調節閥控制(圖1q)，并由連于出口處的壓力換能器(圖1p)監測。

實驗中應用計算機輸出壓力指令程序化控制壓力調節閥(PRE-U，德國Hoerbiger公司)，該閥門進而控制高壓純氧(0.15 MPa) 的流量輸出預定氣壓。此壓力用于推動儲液瓶中的灌流液進入血管(頸動脈竇內)內，同時鉗制竇內壓[4-5]。血管內灌流速度為 5 mL/min。血管內灌流液出口處安置壓力換能器(YH-4，北京航天醫學工程研究所)，用于記錄竇內壓。

2 結果

竇神經放電活動的記錄：以單極記錄法引導竇神經放電。 將制備好的頸動脈竇-竇神經標本如圖1固定于標本槽內，竇神經從血管槽引至神經槽。應用硅酯將血管槽與神經槽間隔板窄縫封嚴，此為提高信噪比的關鍵。神經放電信號經前級(A1 402， 美國Axon instrument公司)、后級(CyberAmp380， 美國Axon instrument公司)放大和濾波，電壓總增益為5 000倍，頻帶300 Hz～10 kHz。放大后的電信號和竇內壓信號由數據采集系統(Digidata 1440， pClamp 10.0， 美國Axon instrument公司)采集(采樣率為20 kHz)。頸動脈竇竇內壓信號與放電信號同步記錄。圖2表示在一例家兔離體頸動脈竇-竇神經標本上記錄的竇神經放電。在波動式和逐漸增加的斜坡式灌流壓下，竇神經顯現出與竇內壓波動一致的規律性壓力依賴性放電活動。

圖1 灌流-記錄槽結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of the perfusion and recording chamber

a： vessel perfusion chamber;b： sinus nerve recording chamber;c，d： entrance and exit of sinus perfusion fluid;e：exit of extravascular perfusion fluid；f： entrance of extravascular perfusion fluid；g： sinus nerve;h： recording electrode;i： an insulating column used to fix the recording electrode in sinus nerve recording chamber;j： a partition between vascular perfusion chamber and sinus nerve recording chamber;k： a narrow gap on the partition allowing sinus nerves to pass through and to be sealed by silicone esters;l： peristaltic pump;m： reference electrode at the bottom of the vessel perfusion chamber;n，o： the ends of the common carotid artery and the external carotid artery were connected to the stainless steel intubation respectively;p： pressure transducer;q： the control valve of the perfusion flow in the sinus;r： the control valve of the extra sinus perfusion flow. The vessel perfusion chamber and the sinus nerve recording chamber are fixed in a heat preservation chamber (not shown)， and the temperature is kept constantly by circulating fluid. The leads of the reference electrode and recording electrode are connected with the input of the amplifier through the bottom plate of the box (not shown).

3 討論

通過離體灌流頸動脈竇-竇神經標本并控制頸動脈竇內壓力，直接觀察頸動脈竇內壓力變化對竇神經放電的影響是器官水平研究頸動脈竇壓力感受器的重要方法之一[6-8]。本課題組經過多年的摸索，研制的這套離體頸動脈竇-竇神經標本灌流與記錄一體化裝置利用一個帶有小縫隙的薄有機玻璃板將標本槽分為血管槽和神經槽。實驗過程中創造性的利用硅脂這種疏水又絕緣的膏狀材料來封閉血管槽和神經槽間的縫隙，既保證竇神經能從血管槽通過縫隙進入神經槽，又能起到隔離血管槽和神經槽的作用，達到灌流和神經放電記錄同步進行，互不干擾。同時，由于硅脂的疏水性，能避免血管槽中的灌流液滲入神經槽，有利于信號記錄過程中信噪比的提高[9]。

圖2 家兔離體頸動脈竇壓力感受器放電活動Fig.2 Discharges of baroreceptor in isolated rabbit carotid sinus

The pressure-dependent discharges were recorded from a carotid sinus-sinus nerve specimen. The discharge activity originated from the baroreceptors according to the relationship between the discharge activity and the change of the pressure in the sinus.CSND： carotid sinus nerve discharge;ISP： intrasinus pressure;△1 mmHg=0.133 kPa.

在血管槽設置了兩條灌流通路，能分別實現血管內、外灌流，便于了解藥物發揮作用的部位。本裝置可以在血管內灌流的出、入口分別安裝竇內壓力控制系統和壓力記錄裝置，實驗過程中可以控制竇內壓力，并在記錄竇內實際壓力的同時記錄竇神經放電，便于對竇內壓力與竇神經放電間的關系進行研究[10]。本研究研制的這套離體頸動脈竇-竇神經標本灌流與記錄一體化裝置，可方便、可靠地實現對離體頸動脈竇-竇神經標本血管內外灌流，同時控制竇內壓力并同步記錄竇神經放電。這套系統對于研究血管壓力感受器的功能具有重要的應用價值。