帕金森鼠結腸黏膜炎性反應與多巴胺和5-羥色胺受體表達

張 悅 李 蘊 張曉麗 馮小燕 權竹聲 朱進霞*

(1.首都醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系，北京 100069; 2.首都醫科大學基礎醫學院免疫學系，北京 100069)

消化道組織內存在大量的多巴胺(dopamine，DA)和5-羥色胺(serotonin，5-HT)，具有重要的胃腸功能調節作用。除了調節胃腸動力和黏膜分泌與吸收外，DA和5-HT都參與黏膜保護，在黏膜炎性反應與黏膜屏障等方面均發揮重要作用。有研究[1]顯示激動DA受體D2可以保護胃腸黏膜，激動D1可以抑制炎性反應小體NLRP3的激活[2]，提示DA及其受體具有一定的抗炎效應。本課題組[3]前期報道5-HT除了調節胃腸動力以外，具有促進結腸黏膜分泌的作用，5-HT可以作用于5-HT4受體升高cAMP促進結腸黏膜上皮細胞分泌，而通過5-HT3受體則可促進生長抑素釋放對上述促分泌作用起到一個負反饋調節效應。同時5-HT在黏膜保護中的作用也有文獻[4-6]報道。

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種以中腦黑質多巴胺能神經元發生進行性丟失作為病理改變的中老年疾病， PD患者除軀體運動功能障礙以外，病程早期常伴發胃腸功能紊亂，出現胃腸動力紊亂(胃輕癱、便秘等)以及黏膜屏障功能損傷，晚期還會出現潰瘍、胃十二指腸反流等。PD的臨床研究[7-8]顯示，在中樞和消化系統存在多種單胺類神經遞質改變，并出現黏膜屏障損傷。本課題組[9]前期研究，PD模型大鼠中，DA在平滑肌的含量明顯升高，可通過抑制結腸動力從而導致便秘。但是PD模型鼠結腸黏膜層中DA和5-HT的含量及其受體的蛋白表達是否發生變化、黏膜是否存在炎性反應和通透性改變未見報道。本研究將觀察5-HT和DA及其受體在結腸黏膜的分布情況，并通過在大鼠雙側黑質注射6-羥多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)模擬PD病癥制作6-OHDA大鼠模型，觀察黏膜炎性反應和通透性的變化，以及5-HT和DA含量及其相關受體的變化。為PD胃腸功能紊亂提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠30只，首都醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號為：SCXK(京)2012-0001。大鼠體質量為200～250 g，經實驗動物倫理委員會許可(動物倫理是批號：AEEI-2015-065)，動物在室溫條件飼養，24 h食水供應，給予正常晝夜光照。斷頸處死后取結腸組織，用解剖鑷剝離出黏膜層并凍存于液氮中；取腦組織，一部分固定包埋用于切片，一部分剝離出黑質核團凍存。

1.2 6-OHDA大鼠模型

1)模型制備：6-OHDA處理組大鼠用賽拉嗪和氯胺酮的混合物麻醉(13，87 mg/kg)后，將大鼠頭部固定于立體定位儀，顱骨暴露出2點(黑質坐標：前囟后5.6 mm，旁開±2.0 mm，深度7.5 mm)，從這2點注入6-羥多巴(購自Sigma公司，美國)，每點注入2 μL，濃度為2 g/L。飼養4周后模型制作完成。

2)糞便含水量：6-OHDA模型大鼠成模后，將6-OHDA和對照組每只大鼠放入1個代謝籠里。收集每只大鼠的糞便，稱質量數值作為濕質量。將收集的糞便在100 ℃條件下烤干48 h，稱質量數值作為干質量。糞便的含水量按照此公式進行計算：糞便含水量=(濕質量-干質量)÷濕質量×100%，比較6-OHDA模型組和對照組大鼠的糞便含水量。

3)行為學檢測：將模型及對照組大鼠置于橫桿上，每只大鼠以圓形隔板隔開，啟動開關后橫桿開始轉動，記錄每只大鼠在轉棒上停留的時間，比較兩組大鼠的運動能力。

1.3 黏膜電阻和通透性檢測

剝離大鼠結腸的黏膜層組織置于2個Ussing chambers中間，平鋪蓋住中間的孔隙并固定，兩側的小室中分別倒入5 mL Kreb’s液(pH值為7. 4)，通入配比為95%(體積分數)O2和5%(體積分數)CO2的混合氣，恒溫水浴37 ℃。通過電極測定黏膜的電阻。

孵育組織的方法同上，從黏膜組織的頂膜側加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)-葡聚糖，每隔30 min從基底側取待測液體，從實驗開始直到1 h，共取3次，第一次液體作為空白對照，通過酶標儀讀數。

1.4 免疫組織化學熒光染色

取材：6-OHDA成模大鼠及對照組大鼠用4%(質量分數)多聚甲醛進行灌流固定，完成后取腦，將腦組織浸泡于4%(質量分數)多聚甲醛溶液中，次日將組織浸泡于15%(質量分數)蔗糖溶液中，第3天換至30%(質量分數)蔗糖溶液中，梯度脫水。待腦組織完全脫水后，根據黑質所在部位切塊包埋，冰凍切片機切厚度為20 μm腦片，漂片于多聚賴氨酸處理的載玻片上，過夜晾干。

切片經檸檬酸鹽緩沖液中微波抗原修復后，自然降至室溫。先后經PBST緩沖液洗片。用5%(體積分數)驢血清封閉30 min，選用一抗為酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)(1∶5 000，小鼠抗大鼠，Sigma公司，美國)，4 ℃過夜孵育。15～16 h后取出組織切片室溫放置1 h，PBST洗3次。滴加二抗 (1∶1 000，驢抗小鼠，購自Invitrogen公司，美國)，孵育2 h后滴加DAPI，5 min后PBST洗片，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 免疫蛋白印跡分析

稱取大鼠黑質或結腸黏膜層組織30 mg左右，加入300 μL蛋白裂解液，將組織剪碎勻漿，低溫超聲至半透明，冰上輕搖30 min，離心5 min(12 000 r/min、4 ℃)。取上清液，測定提取的蛋白濃度，調平后在95 ℃水浴中煮5 min，以每孔100 μg蛋白上樣。

80 V電壓約30 min，待蛋白跑齊更換電壓至120 V約1 h，取出凝膠，與硝酸纖維素膜(PVDF膜)按順序疊放，以295 mA轉膜90 min。用5%(質量分數)脫脂奶粉封閉1 h。分別用一抗D1、D2、D5、5-HT3和5-HT4、TH及內參GAPDH， 4 ℃孵育約15 h，次日取出室溫輕搖30 min，TBST洗膜，孵育綠色熒光二抗2 h，TBST洗膜后TBS浸泡，使用Odyssey系統掃描成像，實驗所用一抗及二抗信息見表1、2。

表1 實驗所用一抗信息Tab.1 Primary antibodies information in these experiments

TH:tyrosine hydroxylase;5-HT:serotonin.

表2 實驗所用二抗信息Tab.2 Secondary antibodies information in these experiments

1.6 高效液相色譜-電化學檢測法(high-performance liquid chromatography-electrochemistry detection, HPLC-EDC)

稱取大鼠結腸黏膜層組織30 mg左右，加入0.4 mol/L高氯酸150 μL，冰浴中超聲勻漿。避光，冰浴靜置1 h后，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，定量吸取上清液約100 μL，加入半量上清液體積即50 μL左右預處理液(檸檬酸鉀、磷酸氫二鉀、 EDTA-2Na混合液)，漩渦混勻。冰浴靜置1 h后，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，吸取上清液測定。

1.7 實時定量PCR檢測(Real-time PCR)

1)RNA的提取:取適量大鼠結腸黏膜組織，研磨碾碎后加入放有1 mL Trizol(Invitrogen公司，美國)的1.5 mL EP管內，混勻后冰上靜置5 min。加入氯仿0.2 mL，劇烈震蕩15 s，冰上靜置2～3 min，離心15 min (4 ℃、12 000 r/min)。吸取上層水相至干凈的離心管中，加入異丙醇[每1 mL Trizol對應0.5 mL 100%(體積分數)異丙醇]。室溫孵育10 min，低溫離心 10 min(4 ℃ 12 000 r/min)。棄掉上層懸液，用75%(體積分數)乙醇洗滌RNA[每1 mL的Trizol加1 mL的75%(體積分數)乙醇]，離心5 min(4 ℃，7 500 r/min)，棄上清，干燥RNA。加入10～20 μL 無酶水溶解，測定濃度后，將RNA反轉錄。

2)反轉錄:取0.1 ng～5 μg的總RNA，依次加入1 μL(50 μmol/L)Oligo (dT)、無RNA酶水至12 μL，65 ℃加熱5 min后冷卻，再分別加入4 μL 緩沖溶液、2 μL 10 mmol/L dNTP Mix、1 μL RiboLock RNase 抑制劑(20 U/μL)、1 μL反轉錄酶。42 ℃孵育60 min， 70 ℃孵育5 min。試劑盒購于美國Thermo公司。

3)實時定量PCR檢測:Real-time PCR用于測定大鼠結腸黏膜層的多巴胺受體D1、D2、和D5及5-HT受體5-HT3和5-HT4的mRNA表達情況。以GAPDH和β-Actin為內參，進行相對定量PCR分析。多巴胺受體D1正向引物序列為5′-GGA TGA CAA CTG TGA CAC AAG GTT G-3′，反向引物序列為5′- AAG CTG ATG AGG GAC GAT GAA-3′；D2正向引物序列為5′- CAC CAC GGC CTA CAT AGC AA-3′，反向引物序列為5′-GGC GTG CCC ATT CTT CTC T-3′；D5正向引物序列為5′-CTA GTG TGT GCT GCC ATC GT-3′，反向引物序列為5′-ACC CAG ATG TCG CAG AAT G-3′，5-HT受體5-HT3正向引物序列為5′-TGC ATA CCA TCC AGG ACA TCA-3′，反向引物序列為5′-CTC TTG TCC GAC CTC ACT TCT TC-3′，5-HT4正向引物序列為5′-GCT GGG TCA TTC CCA TGT TT-3′，反向引物序列為5′-CAA CTA TGC CGA TGT TGT TCC A-3′，β-Actin正向引物序列為5′-TTC AAC ACC CCA GCC ATG T-3′，反向引物序列為5′-GTG GTA CGA CCA GAG GCA TAC A-3′。GAPDH引物購于上海生工公司。反應體系按中國Stransgen公司的試劑盒說明操作。94 ℃變性5 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s， 40個循環后讀取數值。

1.8 酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

使用腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(ER006，ExCell)、白介素(interleukin，IL)IL-6(ER003，ExCell)、IL-1β(ER008，ExCell)的Elisa試劑盒，操作如下：取出抗體包被的板條，留空白孔，其他每孔加入100 μL樣本或標準品，隨后每孔添加50 μL生物素化抗體工作液，封住反應孔，室溫孵育120 min。洗板5次，除空白孔外，每孔加入100 μL酶結合物工作液，封住反應孔，室溫孵育60 min。洗板5次，每孔加入顯色底物100 μL，室溫避光孵育15 min。加入100 μL終止液，混勻后測量450 nm的A值。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 6-OHDA大鼠模型鑒定

為驗證6-OHDA大鼠模型是否造模成功，本研究采用免疫熒光染色法和免疫蛋白印跡技術觀察模型和對照組大鼠黑質多巴胺的合成酶TH的分布和蛋白表達。結果如圖1A和B所示，6-OHDA模型組大鼠黑質TH蛋白的表達明顯降低，從0.335±0.073(對照組)下降到0.132±0.028(n=7，P<0.05)說明定點損毀黑質DA能神經元成功；行為學檢測結果(圖1C)顯示，6-OHDA大鼠的轉棒停留時間從(35.330±3.148)s縮短至(24.000±1.424)s，提示模型鼠出現軀體運動功能障礙(n=6，P<0.01)；進一步檢測發現6-OHDA模型大鼠糞便的含水量從(0.119±0.005)%到(0.062±0.006)%(n=4，P=0.000)顯著降低(圖1D)，PD伴便秘模型成功。

2.2 6-OHDA大鼠結腸黏膜通透性與炎性反應因子的改變

為觀察6-OHDA模型大鼠結腸黏膜的屏障功能，本研究檢測了黏膜電阻、FITC-葡聚糖的通過量以及炎性反應因子表達量。結果如圖2A和B所示， 在6-OHDA大鼠結腸黏膜，FITC-葡聚糖的通過量在60 min時由(18.86±1.856)μg/L(對照組)升高至(37.000±4.457)μg/L，明顯增加(n=4，P<0.01)，表明6-OHDA大鼠結腸黏膜的通透性增加，此外，膜電阻值從(73.750±4.024)Ω/cm2(對照組)降到(53.400±6.282)Ω/cm2(n=7，P<0.05)，間接反映了黏膜通透性增加，提示黏膜屏障功能出現異常。雖然兩組大鼠結腸黏膜中炎性反應因子IL-6[對照組(156.3±9.416)ng/g，模型組(203.2±19.34)ng/g]與IL-1β的含量[對照組(210.1±23.92)ng/g；模型組(186.5±24.41) ng/g]差異無統計學意義(圖2C，n=5，P>0.05)，但TNF-α的含量明顯升高[對照組(269.1±18.00)ng/g；模型組(340.4±21.52)ng/g](圖2C，n=5，P<0.05)，6-OHDA大鼠結腸出現輕度炎性反應。

圖1 6-OHDA大鼠模型鑒定Fig.1 Identification of the 6-OHDA rats model

A: distribution of tyrosine hydroxylase (TH) in substantia nigra in control and 6-OHDA rats (TH is the synthetic rate-limiting enzyme of DA);B: expression of TH protein in substantia nigra in control and 6-OHDA rats，n=7，*P<0.05vscontrol;C: Rotarod test between 6-OHDA and control rats，n=6，**P<0.01vscontrol;D: fecal water content between 6-OHDA and control rats，n=4，***P=0.000vscontrol;6-OHDA:6-hydroxydopamine；DA：dopamine.

圖2 6-OHDA大鼠結腸黏膜電阻、FITC-葡聚糖透過量及炎性反應因子的改變Fig.2 Changes of mucosaltransepithelial resistance， FITC-dextran concentration of through mucosa， and mucosal inflammatory factors in colon of 6-OHDA rats

A: transepithelial resistance of colonic mucosa incontrol and 6-OHDA rats，n=7，*P<0.05vscontrol;B: colonic mucosa FITC-dextran permeability in control and 6-OHDA rats，n=4，**P<0.01vscontrol;C: content of inflammatory factors of colonic mucosa in control and 6-OHDA rats，n=5，*P<0.05vscontrol;6-OHDA:6-hydroxydopamine;TNF-α:tumor necrosis factor-α;IL:interleukin.

2.3 6-OHDA大鼠結腸黏膜層內DA和5-HT含量及其受體的表達

對照組與6-OHDA組大鼠結腸黏膜組織中DA含量分別為(44.240±2.371)ng/g和(42.610±4.521)ng/g，兩者間差異無統計學意義(n=6，P>0.05)。同樣，5-HT的含量(662.7±49.59)ng/g與對照組(625.4±77.83)ng/g，差異無統計學意義(n=6，P>0.05)。詳見圖3。

Real-time PCR結果顯示多巴胺受體D1、D2和D5與5-羥色胺受體5-HT3和5-HT4mRNA在結腸黏膜廣泛分布。進一步釆用Western blotting法檢測了這些受體在模型大鼠結腸黏膜中的蛋白表達変化。模型大鼠結腸黏膜中的D1和D5明顯降低(D1：對照組：0.728±0.132，模型組：0.272±0.067，n=7，P<0.01；D5：對照組：0.721±0.036，模型組：0.543±0.051，n=6，P<0.05)。5-HT3雖有升高趨勢，但差異無統計學意義(對照組：0.078±0.016，模型組：0.103±0.034，n=4，P>0.05)。D2(對照組：0.699±0.064，模型組：0.547±0.078，n=7，P>0.05)和5-HT4(對照組：0.038±0.007，模型組：0.047±0.010，n=7，P>0.05)，兩組間差異無統計學意義，詳見圖4。

圖3 6-OHDA大鼠結腸黏膜層內DA和5-HT的含量測定Fig.3 Content of DA and 5-HT in the colonic mucosa of control and 6-OHDA rats

6-OHDA：6-hydroxydopamine；DA：dopamine；5-HT：serotonin.

圖4 DA和5-HT受體在大鼠結腸黏膜層中的mRNA和蛋白表達Fig.4 mRNA and protein expression of DA and 5-HT receptors in colonic mucosa of rats

A: mRNA expression of DA receptors in colonic mucosa of normal rats,n=4;B: Western blotting results of DA receptors；C: statistical chart of DA receptors in colonic mucosa of control and 6-OHDA rats,D1:n=7,D2:n=7,D5:n=6,*P<0.05vscontrol，**P<0.01vscontrol;D: mRNA expression of 5-HT receptors in colonic mucosa of normal rats,n=4;E:Western blotting results of 5-HT receptors；F: statistical chart of 5-HT receptors in colonic mucosa of control and 6-OHDA rats,5-HT3:n=4,5-HT4:n=7；DA: dopamine;5-HT: serotonin；6-OHDA: 6-hydroxydopamine.

3 討論

本研究模擬臨床PD患者制作6-OHDA大鼠模型，觀察到模型大鼠出現便秘，且黏膜電阻降低，FITC-葡聚糖通過量增加，以及黏膜炎性反應因子TNF-α含量升高，提示結腸黏膜通透性增加并出現輕度炎性反應。進一步還發現，6-OHDA大鼠結腸黏膜層內DA的含量和D2不變，但D1和D5兩種DA受體的蛋白表達水平顯著低于對照組。5-HT3的表達有升高趨勢，而5-HT的含量和5-HT4無變化，人體90%的5-HT來源于消化道組織，對胃腸功能調節發揮非常重要的作用。除對動力調節外，5-HT通過激活上皮細胞的5-HT4受體刺激結腸分泌，而黏膜下神經叢中的5-HT3，則通過刺激生長抑素的釋放，間接地抑制結腸黏膜的離子轉運。本研究發現PD鼠5-HT3表達有升高趨勢，但差異無統計學意義，可能對黏膜分泌有一定的影響，與模型鼠糞便含水量降低有一定關系。但仍需進一步實驗證明。

有研究[14]顯示，在潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩(Crohn disease，CD)患者發炎的結腸黏膜層中，DA的含量明顯減少；在三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)誘導的結腸炎模型中，結腸組織的DA濃度也顯著降低。這提示DA可能參與結腸炎性反應。并且，DA可以通過D1受體抑制炎性反應小體NLRP3的激活和全身系統性的炎性反應，通過D2受體抑制急性胰腺炎，提示DA可能通過D1或者D2受體發揮抑炎作用。另有文獻[15-18]顯示PD患者及模型大鼠的結腸均出現低度炎性反應，本研究發現6-OHDA大鼠結腸的炎性反應因子TNF-α含量升高，結合結腸黏膜中DA受體D1和D5表達減少，筆者推測，6-OHDA大鼠結腸黏膜D1和D5的表達降低可能與其輕度炎性反應有關。總之，本研究進一步揭示了DA及其受體與結腸黏膜保護功能相關，但其內在的機制還需進一步研究。

綜上所述，DA與5-HT是胃腸組織中重要的單胺類生物活性物質，具有調節胃腸動力與黏膜水電解質轉運以及保護胃腸黏膜等重要生理功能。本研究中6-OHDA大鼠表現有便秘，其結腸黏膜通透性增加、炎性反應因子TNF-α升高，提示其結腸黏膜存在有炎性反應。本研究中雖未檢測到6-OHDA大鼠結腸黏膜中DA與5-HT含量、以及5-HT受體表達的顯著性變化，但多巴胺受體D1和D5的蛋白表達明顯降低。DA受體下調是否與PD鼠結腸炎性反應相關有待進一步研究。