超高效液相色譜-串聯質譜法測定水產品中22種鄰苯二甲酸酯類環境激素

方道贈，王 寧，張 亮，李 娜，隋玉杰

0 引言

環境激素，又稱內分泌干擾物，是指一類外源性化合物，具有類似雌性激素的作用，可通過干擾生物體內天然激素的產生、代謝或排出而影響正常的激素功能，從而造成內分泌、生殖系統紊亂或病變[1-2]。環境激素種類眾多，包括人工合成激素、農藥類、鄰苯二甲酸酯類、金屬化合物類等[3]。其中，鄰苯二甲酸酯類化合物因在塑料制品、化妝品、涂料、農藥等行業具有廣泛的需求，因此每年的產量也相當驚人，有幾百萬噸之多。而因其不會與基質之間形成共價鍵，極易從基質中釋放出來，對大氣、土壤、水環境造成污染[4]。在進入水環境后，由于其較高的脂溶性，極易被水中生物吸收，且具有蓄積性，最終通過水產品進入人體，長期累積將對人體造成危害。因鄰苯二甲酸酯類化合物的污染和危害性，已被國內外列為優先控制污染物。

目前，我國水產品中鄰苯二甲酸酯類環境激素的檢測研究工作還在起步階段，且檢測方法研究主要集中在氣相色譜法[5-6]、氣相色譜-質譜聯用法[7-8]、高效液相色譜法[9]等。超高效液相色譜-串聯質譜法利用保留時間與特征離子對動態多反應監測相結合，可大大降低多種待測物同時檢測時的相互干擾，且靈敏度明顯優于以上3種方法，彌補了以上3種方法易出現假陽性、檢出限高等問題，是今后水產品中鄰苯二甲酸酯類環境激素檢測方法的趨勢所向。

研究采用超高效液相色譜-串聯質譜法，結合固相萃取前處理技術，對水產品中22種鄰苯二甲酸酯類環境激素：鄰苯二甲酸單甲酯（MMP）、鄰苯二甲酸單丁酯（MBP）、鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二異丙酯（DIPP）、鄰苯二甲酸二丙酯（DPRP）、鄰苯二甲酸二苯酯（DPHP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）、鄰苯二甲酸芐基丁基酯（BBP）、鄰苯二甲酸二環己酯（DCHP）、鄰苯二甲酸二己酯（DHXP）、鄰苯二甲酸二庚酯（DHP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸二辛酯（DOP）、鄰苯二甲酸二異辛酯（DIOP）、鄰苯二甲酸二（2-甲氧基） 乙酯（DMEP）、鄰苯二甲酸二（4-甲基-2-戊基酯） （BMPP）、鄰苯二甲酸二（2-乙氧基） 乙酯（DEEP）、鄰苯二甲酸二戊酯（DPP）、鄰苯二甲酸二 （2-丁氧基） 乙酯（DBEP）、鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP） 開展檢測技術研究。

1 試驗材料與方法

1.1 儀器與試劑

1290/6470型超高效液相色譜-串聯質譜儀，美國Agilent公司產品；KQ-500DB型超聲波發生器，昆山舒美超聲儀器有限公司產品；24位固相萃取裝置、500 mg/6 mL Si/PSA SPE玻璃固相萃取柱、EFAA-DC24-RT型氮吹儀，上海安譜實驗科技股份有限公司產品；Research Plus型微量移液器，美國Eppendorf公司產品；超純水處理系統，美國Millipore公司產品。

MMP（98.0%），DMP（99.6%），DMEP（98.0%），MBP（98.0%），DEP（99.1%），DEEP（99.5%），DIPP（99.0%），DPRP（98.0%），DPHP（99.8%），DIBP（99.5%），BBP（98.5%），DBP（99.4%），DBEP（99.0%），DPP（99.2%），DCHP（98.7%），BMPP（99.0%），DHXP（98.0%），DHP（99.0%），DIOP（99.4%），DEHP（99.3%），DOP（99.3%），DINP（99.0%） 標準物質，購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯、正己烷、甲醇、甲酸均為色譜純，購上海安譜實驗科技股份有限公司；乙酸銨、色譜純，購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 標準溶液配制

稱取22種標準物質適量于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，分別配制成質量濃度為1 000 mg/L的單標儲備液。取22種儲備液各1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，制得10 mg/L混合標準中間液，以上溶液均于-20℃下保存。臨用時，取混合標準中間液適量，用空白樣品前處理所得基質溶液配制成質量濃度為 10，50，100，200，1 000 μg/L 的混合標準工作液，用于繪制標準曲線。

1.3 試驗方法

1.3.1 前處理條件

準確稱取5 g剪碎的魚肉樣品于100 mL錐形瓶中，加入20 mL乙酸乙酯、5 g無水硫酸鈉，用均質器均質1 min，靜置30 min后移取上清液至50 mL刻度玻璃試管中，殘渣中再加入20 mL乙酸乙酯，超聲10 min后過濾，合并移至50 mL刻度玻璃試管中，用乙酸乙酯定容至50 mL。移取10 mL提取液至玻璃離心管中，于50℃下氮吹至近干，再用5 mL正己烷溶解，旋渦均勻，待SPE凈化。

將Si/PSA SPE玻璃萃取小柱裝至固相萃取裝置上，用5 mL正己烷活化，棄去流出液，將待凈化液加入萃取小柱中，用4 mL正己烷分2次洗滌離心管并過柱，再用4 mL正己烷淋洗小柱，待小柱抽干后用5 mL乙酸乙酯洗脫，洗脫液收集后經50℃氮吹至近干，甲醇定容至5 mL，經0.22 μm有機濾膜過濾至進樣瓶，待儀器進樣分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流速0.2 mL/min，柱溫35℃，進樣量5 μL，流動相A為甲醇（含0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨），流動相B為水（含0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨）。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.3 質譜條件

電離方式ESI+；毛細管電壓3 500 V；干燥氣溫度325℃；干燥氣流速11 L/min；霧化器壓力45 psi；監測模式為多反應監測（MRM）。

22種鄰苯二甲酸酯類環境激素的多反應監測參數見表2。

2 結果與分析

2.1 色譜圖

22種鄰苯二甲酸酯類環境激素的色譜見圖1。

表2 22種鄰苯二甲酸酯類環境激素的多反應監測參數

試驗表明，在流動相中加入甲酸可促進化合物的離子化，乙酸銨的加入可有效改善目標化合物的峰形，提高檢測靈敏度和穩定性；通過調節流動相梯度洗脫程序，使22種目標化合物在27 min內得到良好的分離。

2.2 標準曲線及線性范圍

空白魚肉樣品經前處理所得樣液作為基質，配制質量濃度分別為 10，50，100，200，1 000 μg/L的混合標準工作液，用優化的儀器方法進行分析，所得色譜圖的峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線。

22種鄰苯二甲酸酯類環境激素的線性方程、相關系數、平均回收率及相對標準偏差見表3。

從表中的結果可以看出，22種目標化合物在10～1 000 μg/L質量濃度范圍內的線性相關系數R2均不低于0.996 8，線性關系良好。

2.3 方法的檢出限

空白魚肉樣品加標10 μg/kg，按照試驗方法進行前處理和儀器分析后，對所得圖譜進行信噪比分析，發現22種鄰苯二甲酸酯類環境激素的信噪比均大于3，因此22種環境激素的檢出限均低于10 μg/kg。

圖1 22種鄰苯二甲酸酯類環境激素的色譜

2.4 方法的回收率和精密度

在空白魚肉樣品中添加50，100 μg/kg的混合標準溶液，按照試驗方法進行前處理和超高效液相色譜-串聯質譜儀器分析，6次獨立重復試驗所得平均回收率和精密度。由表3可知，22種環境激素的平均回收率在83.5%～103.1%，RSD均低于9%，表明該方法準確度較高、精密度良好。

3 結論

利用超高效液相色譜-串聯質譜法實現了對水產品中22種鄰苯二甲酸酯類環境激素的測定。利用該試驗方法可使22種目標化合物得到有效分離，在10～1 000 μg/L質量濃度范圍內線性良好，回收率為83.5%～103.1%，RSD為2.1%～8.2%，檢出限均低于10 μg/kg。該方法可為水產品中環境激素風險的監控提供技術支持，也可為相關標準的制定奠定基礎。

表3 22種鄰苯二甲酸酯類環境激素的線性方程、相關系數、平均回收率及相對標準偏差