果蔬中不可萃取多酚的研究進展

鄧雅妮，郭時印，肖 航，唐忠海

果蔬中富含活躍而具有保健作用的植物化學(xué)物質(zhì)，多酚是其中主要的具有功能活性的一種次生代謝產(chǎn)物，分子結(jié)構(gòu)中有若干酚性羥基，在大多數(shù)植物性食物中的幾乎所有器官中都很常見[1]。根據(jù)多酚的結(jié)合方式和萃取方法的不同，分為可萃取多酚（Extractable polyphenol，簡稱EP） 和不可萃取多酚（Non-extractable polyphenol，簡稱 NEP）[2-4]。NEP 的測定不能用單純的溶劑提取，需要通過化學(xué)或酶處理萃取物的殘渣以打破多酚物質(zhì)與細胞壁結(jié)合的化學(xué)鍵，才能將其分離出來[2-3]。大多數(shù)文獻中的多酚僅局限于EP，然而據(jù)已有研究表明，不可萃取多酚的含量在多種植物資源中遠高于可萃取多酚，且不可萃取多酚在人體腸道中能產(chǎn)生可被吸收的代謝產(chǎn)物，表現(xiàn)出較可萃取多酚更強的抗氧化作用，以及在胃腸道方面的生理作用。綜述了果蔬中不可萃取多酚（NEP）的研究進展，重點是不可萃取多酚的提取、測定、生物可利用性及與健康相關(guān)的特性，以期為果蔬中不可萃取多酚在食品中進一步的研究和生物活性方面的應(yīng)用提供參考和思路。

可萃取多酚和不可萃取多酚見圖1[5]。

1 果蔬中的不可萃取多酚

圖1 可萃取多酚和不可萃取多酚

EP是指通過簡單的水或有機溶劑萃取就可獲得的由低分子量化合物組成的混合物，包括可萃取原花青素（EPA）、一部分水合單寧酸（HT），以及其他黃酮類、酚酸等。NEP也被稱為高分子抗氧化劑，主要是指結(jié)合于細胞壁上的一些不可萃取原花青素（Non-extrable proanthocyanidins，簡稱 NEPA） 和可水解多酚（Hydrolysable polyphenols，簡稱HP），約占總多酚的57%[3]。在上個世紀70年代，不可萃取原花青素在豆科植物中被發(fā)現(xiàn)，但由于當(dāng)時缺乏先進的分析和檢測手段而未受到重視，直至上世紀90年代國外科學(xué)家才開始對植物性食物中的不可萃取多酚進行深入研究，2007年Fulgencio Saura Calixto帶領(lǐng)的團隊研究了傳統(tǒng)西班牙飲食中果蔬、豆類、谷類等食物中的NEP[4]。2009年Sara Arranz提出植物性食物中NEP的含量被遠遠低估了[2]。近年來，國內(nèi)學(xué)者如程安瑋[6]、韓彩靜[7]、閻海青[8]等人開始關(guān)注并研究果蔬中的NEP，研究較多的是藍莓果實及葉、洋蔥、火棘等膳食多酚含量豐富的果蔬。

2 不可萃取多酚的提取

對不可萃取多酚的提取，其中原料的處理包括新鮮、凍干或烘干呈粉末狀的[9]。用有機溶劑萃取時一般選擇甲醇、乙醇，除此之外丙酮、乙酸乙酯等也常被應(yīng)用。

2.1 酸水解法

2007年西班牙學(xué)者Fulgencio Saura Calixto等人提出用酸法提取不可萃取多酚，先使用甲醇和丙酮萃取樣品中的可萃取多酚，留濾渣備用。然后，使用5 ml/L的HCl-丁醇溶液，于100℃條件下提取3 h，萃取出殘渣中的不可萃取原花青素（NEPA）。利用分光光度計，于波長550 nm處測定吸光度，根據(jù)在相同條件下處理得到的角豆莢的單寧含量繪制的標準曲線，計算出NEPA的含量。同時用甲醇-硫酸（90∶10）溶液，于85℃條件下提取20 h處理得到可水解多酚（HPP），可水解多酚主要是由可水解單寧、酚酸、羥基肉桂酸組成，在強酸的作用下便從殘渣中萃取出來。將過濾后的水解產(chǎn)物注射到反向色譜中的C18柱中，通過色譜法進行測定。結(jié)果顯示，果蔬中不可萃取多酚（包括NEPA和HTT） 的含量遠高于可萃取多酚，水果中不可萃取多酚和可萃取多酚含量分別約為 19.3±3.58 mg/（g·DW），5.38±0.20 mg/（g·DW），蔬菜中不可萃取多酚和可萃取多酚含量分別約為 4.56±0.33 mg/（g·DW），0.86±0.13 mg/（g·DW），其中不可萃取原花青素沒有在蔬菜中檢測出來[4]。2009年西班牙學(xué)者Sara Arranz也用類似方法提取不可萃取多酚，結(jié)果顯示不可萃取多酚的含量是可萃取多酚的5倍多[2]。程安瑋等人[6]用酸性提取方法對藍莓中NEP進行了研究，測定到藍莓中NEPP的含量遠遠高于EP的含量，甚至超過7倍，最高的含量達到23.63±1.22 mg/（g·DW）。

2.2 堿水解法

除了應(yīng)用較多的酸水解法處理外，不可萃取多酚還能用堿法提取，2013年閻海清等人[8]采用堿法提取藍莓中的不可萃取多酚，樣品經(jīng)過乙醇處理，再經(jīng)超聲、離心等操作后，收集沉淀，烘干、粉碎，將NaOH溶液加入離心管進行超聲處理，然后離心、過濾，收集萃取液，即得到不可萃取多酚溶液。程安瑋等人[6]通過比較發(fā)現(xiàn)，堿水解法處理得到的NEP的含量遠比酸水解法多，最大值可達到54.96 mg/（g·DW）[10]。

2.3 其他方法

隨著分析檢測技術(shù)的進步，人們開始使用更先進的方法，如酶法提取、超聲或微波輔助萃取、減壓萃取法提取植物性食物中的多酚。若要想得到純度較高的不可萃取多酚溶液，就需要對粗萃取液進行分離純化。國內(nèi)學(xué)者程安瑋等人[6]2010年采用超聲輔助酸水解的方法萃取藍莓中不可萃取多酚，2014年閻海青等人[8]采用超聲輔助NaOH堿水解的方法對不可萃取藍莓多酚的萃取工藝進行研究，并利用大孔樹脂動態(tài)吸附、乙酸乙酯層析獲得純度較高的不可萃取多酚溶液，再利用高效液相色譜法分析其組分，發(fā)現(xiàn)不可萃取多酚的組成主要是燕草色素類、飛燕草色素類、牽?；ㄉ仡?、矢車菊色素類、芍藥花色素、錦葵色素類和乙?；幕ㄉ?，與可萃取多酚大致相似[11]。韓彩靜等人[7]研究采用大孔樹脂HPD-IOOC進NEP的動態(tài)純化，得到相同的結(jié)論。

3 不可萃取多酚的代謝和生物可利用性

果蔬中的不可萃取多酚被人體攝入后，不能在口腔、胃、小腸中從食品基質(zhì)中被釋放，而是保持完整地到達結(jié)腸，被結(jié)腸內(nèi)微生物群發(fā)酵，糖苷鍵斷裂形成苷元或進一步發(fā)生環(huán)裂解，產(chǎn)生具有生物活性的代謝產(chǎn)物，從而被人體吸收利用或排泄[12]，這些代謝產(chǎn)物能在人體的尿液或糞便中檢測出來[13]。NEP在結(jié)腸中的釋放機制主要有2種，一是與糖、有機酸、脂類等酯化的酚類在結(jié)腸菌群產(chǎn)生的酯酶作用下斷裂酯鍵。二是鞣花單寧等聚合物則需微生物裂解其共軛基團[14]。一些學(xué)者指出不可萃取原花青素在結(jié)腸內(nèi)被分解成苯乙酸、苯丙酸、苯丁酸或其羥基化合物，酚酸經(jīng)腸道直接吸收或與腸道細胞表面特定或非特定受體結(jié)合，通過影響多個基因的表達和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮生理功能[15-16]。水解單寧等聚合物則在腸道微生物（如大腸桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌、桿菌、真桿菌等）的作用下了進行生物轉(zhuǎn)化[17]。也有學(xué)者提出鞣花單寧在微生物群的作用下水解成鞣花酸、尿石素等，能在血液中檢測出來[18]。Kubow S等人[19]研究發(fā)現(xiàn)，紫肉甘薯中花色素苷降解和生物有效性依賴于結(jié)腸微生物的分解。Padayachee A等人[20]研究發(fā)現(xiàn)果蔬中與胞壁結(jié)合的多酚在結(jié)腸中通過細胞壁降解菌作用而被釋放。P??Rez-Jim??Nez J等人[13]指出NEP的代謝產(chǎn)物在人體內(nèi)的循環(huán)時間比EP長，使得NEP部分的食品基質(zhì)能夠在結(jié)腸內(nèi)發(fā)酵得更久。

關(guān)于不可萃取多酚的生物活性在上個世紀就通過體外試管試驗和動物試驗證實了[21]，試驗顯示NEP不受腸道內(nèi)消化液的干擾，必須經(jīng)過腸道酶或微生物菌群水解，釋放酚苷元才能被吸收，結(jié)腸內(nèi)的微生物發(fā)揮了非常重要的作用。在吸收過程中，膳食多酚先后在腸和肝臟中代謝，主要包括甲基化、硫酸化、葡萄糖醛酸化。吸收后一部分多酚進入血液循環(huán)，一部分被外排回腸腔。酚類化合物的母核結(jié)構(gòu)以及羥基的數(shù)目和位置影響它們與代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運載體的親和力，在胃腸道體現(xiàn)不同的吸收特性，最終影響膳食多酚的生理效應(yīng)和功能活性。其他成分的存在，如多糖和蛋白質(zhì)，可能會影響NEP的發(fā)酵效率，有研究顯示，膳食纖維的存在可以促進不可萃取多酚的結(jié)腸發(fā)酵[22]。

4 不可萃取多酚的生物活性

早在2000年，就有學(xué)者結(jié)合體外試管試驗[23-24]、細胞培養(yǎng)[25]、動物試驗[26]、人體試驗[27]來研究NEP與健康相關(guān)的特性。許多研究顯示，NEP在腸胃道健康方面發(fā)揮了重要作用，主要通過以下幾個機制的綜合作用：一是NEP能增強促進結(jié)腸內(nèi)容物抗氧化能力和內(nèi)源性抗氧化劑的表達，從而抵抗存在于結(jié)腸內(nèi)的促腫瘤活性氧簇 （ROS）[12，13，28-29]。許盈芄等人[30]對火棘中不可萃取多酚的研究表示，ABTS及FRAP抗氧化能力均與NEPP含量呈良好正相關(guān)。二是促進腸道益生菌的增殖，減少有害菌的比例[31]。三是上皮組織誘導(dǎo)的細胞凋亡以及隱窩數(shù)量和尺寸的減小，促進了抗增殖能力[29]。四是對腸道癌癥的抑制作用[32]。五是對基因表達的調(diào)節(jié)作用[33]。除此之外，在結(jié)腸內(nèi)產(chǎn)生的這些代謝產(chǎn)物還能預(yù)防腦血管疾病（CVD） 的發(fā)生，降低血壓、血糖和血漿膽固醇[33-34]，NEP對慢性疾病的影響成為當(dāng)今的研究熱點。

5 結(jié)語

不可萃取多酚主要由不可萃取原花青素和可水解多酚組成，雖然果蔬中不可萃取多酚的研究遠少于可萃取多酚，但已有研究顯示不可萃取多酚的含量遠高于可萃取多酚。不可萃取多酚在結(jié)腸中的代謝和生物可利用度，與腸道健康方面有緊密聯(lián)系，對慢性疾病能起到預(yù)防和治療的作用，也因此果蔬中不可萃取多酚潛藏的價值成已為討論的熱點。但是其在人體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化途徑的相關(guān)數(shù)據(jù)尚不夠明確，生物可利用度也不高，有待進一步的研究。