山東省黃瓜細菌性莖軟腐病病原菌鑒定與抗病品種篩選

熊凱琳 劉文寶 張衛華 方守國 馮傳榮

摘要：本試驗以黃瓜細菌性莖軟腐病病原菌為研究對象，對黃瓜田間發病情況進行觀測，分離病原菌并對其形態、致病性及生理生化特性進行分析測定和分子生物學鑒定，同時利用該菌對36份黃瓜資源進行抗病篩選。結果表明：研究地塊黃瓜細菌性莖軟腐病發病率為5.62%～43.76%，平均為24.69%。病田中分離得到的黃瓜細菌性莖軟腐病病原菌經鑒定為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。36份黃瓜資源中篩選得到2份高感資源，24份感病資源，10份中抗病資源。

關鍵詞：黃瓜細菌性莖軟腐??；熒光假單胞菌；抗病資源

中圖分類號：S436.421.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）07-0133-05

Abstract In this experiment， with the pathogen of cucumber bacterial stem soft rot as study object， the morbidity situation of cucumber in the field was observed. The morphological， pathogenicity， physiological and biochemical characteristics of the pathogenic bacteria were analyzed and molecular biology identification was conducted. Then the bacteria was used to screen the resistant varieties from 36 cucumber resources. The results showed that the incidence of cucumber bacterial stem soft rot was 5.62%～43.76%， with an average of 24.69%. The pathogen of cucumber bacterial stem soft rot isolated from the disease field was identified as Pseudomonas fluorescens. There were 2 high-susceptive cultivars， 24 middle-susceptive cultivars and 10 resistant cultivars in 36 cucumber resources.

Keywords Cucumber bacterial stem soft rot； Pseudomonas fluorescens； Resistant resources

黃瓜為葫蘆科黃瓜屬一年生草本植物，富含維生素、蛋白質、尼克酸、鈣、磷、鐵等營養成分，具有清熱止渴、利水消腫的作用[1]，是我國一種日常食用的蔬菜。

黃瓜細菌性莖軟腐病是黃瓜上常見且嚴重發生的病害之一，主要為害葉片、葉柄，還可侵染莖蔓和果實，因受害部位會流出膠狀物，又叫“黃瓜流膠病”。該病近幾年在山東省、山西省、河北省、河南省、遼寧省等黃瓜主產區大面積發生[2]，造成嚴重經濟損失。葉片感病多從葉緣開始發病，形成褪綠病斑并伴有黃色暈圈，后隨病情發展病斑變為黃褐色。莖干發病初期，發病部位呈水浸狀，有流膠現象，濕度大時可見大量白色菌膿溢出。成株期果實發病時，果實表面正常，縱向剖開果實，其內部組織已變褐腐爛或呈開裂狀，嚴重時表面出現白色膿狀物[3-5]。李煥玲[6]經過形態學和分子生物學鑒定，表明引起黃瓜莖軟腐病病原菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西變種（Pectobacterium carotovorum subsp. Brasiliense），但未進行抗病資源篩選。本研究對黃瓜細菌性莖軟腐病田間發病情況進行觀測，對引起山東省黃瓜細菌性莖軟腐病的病原進行鑒定，并對36份黃瓜資源進行抗病性篩選，以期為培育優良的抗黃瓜細菌性莖軟腐病品種提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃瓜細菌性莖腐病病原菌于2016年11月取自濟南市育苗場典型的黃瓜發病植株，常規方法保存。

待測黃瓜資源36份，由山東省農業科學院蔬菜花卉研究所植保室提供。均于2017年10月23日播種，每份材料種植25株，常規田間管理。

1.2 田間調查發病情況

2016年7月至2017年10月在濟南市育苗場調查黃瓜莖軟腐病地上部和根部的危害癥狀。采取5點取樣法調查田間發病率，計算病情指數。

1.3 室內病原菌分離及相關鑒定

1.3.1 分離與純化 利用LB培養基對采集的病葉進行病原菌分離。具體方法為：用滅菌解剖刀切取葉片病健交界處，用70%乙醇浸泡10～30 s，無菌水沖洗2～3次[7]，將消毒后的葉片放入無菌水中用鑷子碾碎，離心30 s，用移液槍吸取上清液涂抹在LB培養基平板上，28℃培養12 h備用。

1.3.2 生理生化測定 待檢測菌株均在LB培養基上培養24 h，參考方中達[7]、蔡妙英等[8]的方法進行測定。

1.3.3 分子生物學鑒定 挑取純化好的待測菌株到LB液體培養基中，在28℃ 200 r/min的搖床中培養12 h 使濃度達到3×108 cfu/mL，將菌懸液于6 000 r/min離心2 min，棄上清，用細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）進行DNA提取，以（F：5′AGAGTTTGATCATGGCTCA3′； R：5′ACGGTTACCTTGTTACGACTT3′）為引物PCR擴增16S rDNA。反應體系20 μL：10 μmol/L上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，2×Taq Mix 10 μL，加滅菌雙蒸水補至總體積20 μL。PCR反應程序：94℃反應5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸105 s，35個循環；72℃延伸5 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳回收后，測序。將所得序列進行比對分析。

1.3.4 致病性鑒定 按照柯赫氏法則接種測定其致病性。具體方法為：將分離純化后的病原菌轉至LB液體培養基中，置于搖床中以28℃、200 r/min振蕩培養12 h，利用噴霧法對黃瓜苗（資源編號GQ14-259、GQ14-247、GQ14-239）進行接種，共接種25株，無菌水作對照，置于大棚中培養，定期保濕，接種后每天觀察并記錄發病情況。

1.4 36份黃瓜資源對黃瓜細菌性莖軟腐病的抗性鑒定

試驗于2017年7月在山東省農業科學院蔬菜花卉研究所基地日光溫室內進行，供試資源的種子均在55～60℃的溫水中浸泡30 min，后放置在28℃恒溫箱中黑暗催芽12 h，出芽后播入穴盤中，穴盤中栽培基質為泥炭、珍珠巖、蛭石以及少量有機肥。在黃瓜苗長出第一片真葉時開始噴霧接種菌液，每菌株接種30株黃瓜幼苗。常規管理，溫室內溫度控制在28℃左右，濕度70%～90%。接種后每天進行發病情況調查，計算發病率和嚴重度。

1.5 數據處理

采用Microsoft Excel 2010進行數據處理及分析。

2 結果與分析

2.1 田間發病情況

田間觀察發現，葉片感病時病斑褪綠變黃，進一步擴展并逐漸發展成為近圓形或不規則病斑，病斑淡黃色，有黃色暈圈。莖、葉柄、卷須被感染時初呈水浸狀，濕度大時可見菌膿溢出后逐漸沿莖縱向擴展，莖部變軟腐爛。瓜條受害時侵染點出現水浸狀病斑，擴展后病斑連成片不規則、呈黃褐色，濕度大時有菌膿溢出，最終導致果實完全腐爛。莖部被感染時水分和營養物質運輸受阻，植株逐漸萎蔫，最終整株枯萎死亡，發病嚴重的地塊可造成植株全部感染（圖1）。經統計，田間發病率為5.62%～43.76%，平均為24.69%。

2.2 病原菌分離分化

對病葉中病原菌進行分離純化后得到四種具有代表性的菌株DT1、DT2、DT3和DT4。DT1菌落黃色，圓形凸起，邊緣呈光滑的波浪狀（圖2A）； DT2菌落淡黃色，表面光滑有光澤（圖2B）；DT3菌落呈白色，圓形凸起，邊緣光滑，表面無明顯光澤（圖2C）；DT4菌落白色，圓形，生長較慢，后產生黃色菌膿（圖2D）。

2.3 病原菌生理生化特性

由表1可知，分離的四種待測菌株均為革蘭氏陰性細菌。DT3在KB培養基上有熒光其余菌株沒有。四種菌株接觸酶反應均為陽性，吲哚反應陰性，明膠液化反應陽性。DT1能利用D-葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、α-乳糖、木糖醇、D-海藻糖、赤蘚醇、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、蜜二糖、D-松三糖、D-來蘇糖產酸。DT2能利用D-葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、α-乳糖、木糖醇、D-海藻糖、赤蘚醇、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、蜜二糖、D-松三糖、D-來蘇糖產酸。 DT3能利用D-葡萄糖、蔗糖、D-海藻糖、蜜二糖產酸。DT4能利用D-葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、α-乳糖、D-棉子糖、木糖醇、D-海藻糖、赤蘚醇、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、蜜二糖、D-松三糖、D-來蘇糖、山梨醇產酸。

2.4 病原菌分子生物學鑒定

對所得4個分離物16S rDNA序列進行比對分析，發現DT1在Genbank中與菌株Aeromonas hydrophila strain SS2（MF445123.1）、Aeromonas sp. FZK4M（KU193769.1）和Aeromonas media strain W-4（KM117162.1）的同源性均達到100%，結合形態學鑒定及生理生化測定結果，將DT1鑒定為氣單胞菌（Aeromonas）。DT2與菌株Aeromonas hydrophila strain TM1（KY786287.1）和Aeromonas hydrophila strain YC-RL3（KR819398.1）的相似性達到99%，結合形態學鑒定及生理生化測定結果，將DT2鑒定為氣單胞菌（Aeromonas）。DT3在Genbank中與菌株Pseudomonas fluorescens strain yangyueP7（KU977136.1）、Pseudomonas fluorescens strain 90F12-2（KT695840.1）和Pseudomonas fluorescens strain 90D7A（KT695838.1）相似性均達到100%，結合形態學鑒定及生理生化測定結果，將DT3鑒定為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。DT4與Enterobacter cloacae菌株T02和RCB426（登錄號為KM538690.1和KT260638.1）同源性達99%，結合形態學鑒定及生理生化測定結果，將DT4鑒定為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）（圖3）。

2.5 病原菌致病性測定

在黃瓜子葉上分別接種DT1、DT2、DT3和DT4的細菌懸浮液，結果表明，菌株DT1、DT2、DT4接種部位出現潰爛并未出現病斑，接種無菌水的對照無明顯變化。在黃瓜苗期，DT3接種在子葉上1 d后，黃瓜葉片未感病。接種第3 d時，子葉接種部位發生潰爛，統計發病率達10.32%（圖4）。接種第5 d時，真葉開始發病，統計發病率達到31.60%。接種第7 d時，發病率達56.48%，莖開始變軟。接種第10 d時，黃瓜幼苗發病率高達91.40%，黃瓜苗伏倒，病情指數達100%。說明DT3能夠導致黃瓜莖軟腐病的發生，后續從黃瓜幼苗的發病組織上也成功分離到DT3。

綜上研究結果表明，P. fluorescens是引起濟南市黃瓜細菌性莖軟腐病的病原菌。

2.6 不同黃瓜資源對Pseudomonas fluorescens菌株（DT3）的抗性差異

接種3 d后36份黃瓜資源均能發病，且資源間的抗性存在差異， 而對照均未發病。由表2可知，GQ14-237、GQ14-243、GQ14-244、GQ14-245、GQ14-254、GQ14-256、GQ14-257、GQ14-268、GQ14-260、GQ14-265為中抗資源，葉片上病斑占50%左右。GQ14-168、GQ14-169、GQ14-170、GQ14-175、GQ14-234、GQ14-239、GQ14-240、GQ14-241、GQ14-242、GQ14-246、GQ14-247、GQ14-248、GQ14-259、GQ14-262、GQ14-263、GQ14-264、GQ14-266、GQ14-267、GQ14-269、GQ14-270、GQ14-273、GQ14-274、GQ14-275、GQ14-276為感病資源。GQ14-253、GQ14-258為高感資源，病斑明顯，并布滿整片葉。

3 討論與結論

本試驗中病原菌材料取自濟南市育苗場的發病植株，對其進行形態學鑒定、致病性鑒定、分子生物學鑒定，結果表明黃瓜莖軟腐病病原菌為P. fluorescens，與李煥玲[6]報道的黃瓜莖軟腐病的病原菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西變種（Pectobacterium carotovorum subsp. Brasiliense）不相符，為國內首次報道。

熒光假單胞菌（P. fluorescens）屬薄壁菌門假單胞菌科假單胞菌屬，在植物上主要作為生防菌使用。近年來，國內外對于熒光假單胞菌的生防作用已有許多報道。熒光假單胞菌能產生十幾種具有抗菌作用的抗生素，這些抗生素可抑制一些病原菌的生長，例如熒光假單胞菌產生的藤黃綠膿菌素對立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、根串珠霉（Thielaviopsis basicola）以及終極腐霉（Pythium ultimum）有拮抗作用；Ahmadzadeh等[10-12]發現熒光假單胞菌PfMDU2產生乙二酸，對植物病原菌產生的草酸具有解毒作用，能夠抗由立枯絲核菌引起的水稻疾病等。本研究發現熒光假單胞菌可引起黃瓜莖軟腐病，但熒光假單胞菌（P.fluorescens）作為植物致病菌的報道較少，前人研究發現P.fluorescens是引發黑松得松材線蟲病的關鍵致病因子之一[13]，呂祝邦利用16S rDNA鑒定到當歸水爛病的病原菌也為熒光假單胞菌[14]。該菌不僅對植物存在致病性，對人和魚也有致病作用。熒光假單胞菌可在一些血液和血制品中繁殖，并且產生內毒素，當病人輸入被熒光假單胞菌污染的血液后，就會導致不可逆的休克[15]。沈曉靜等[16]證實熒光假單胞菌kc-1菌株能引起錦鯉赤皮病，致死率達100%。

P.fluorescens可引起黃瓜莖軟腐病，推測可能是由于熒光假單胞菌分泌的一種有毒物質導致黃瓜發病，我們將會對其致病機理做進一步研究。

防治黃瓜莖軟腐病最環保也是最安全的辦法是使用抗病品種，本研究通過對36份黃瓜資源進行抗病性篩選，發現10份中抗資源，具有抗性的黃瓜資源較少，還需進一步在該病的致病研究的基礎上篩選出更優秀的抗病資源。

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