中國大陸新記錄種珊瑚擬青霉的分離鑒定及其培養基優化

陳文華 譚會穎 劉政 邴帥 鄭曉文 王安冉 徐凌川

摘要：從山東省濟南市佛慧山采集到一株寄生于君遷子（Diospyros lotus L）種子上的擬青霉屬（Penicilliopsis）真菌，經系統分類學研究和DNA分子測序，確定其為中國大陸新記錄種Penicilliopsis clavariaeformis Solms，并將其命名為“珊瑚擬青霉”。選擇多種培養基對該菌株進行培養并對其形態特征進行了觀察。

關鍵詞：中國大陸；新記錄種；珊瑚擬青霉

中圖分類號：S182文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）07-0145-04

Abstract One Penicilliopsis fungus was isolated from seeds of Diospyros lotus L. collecting from Fohui Mountain in Jinan of Shandong Province. After systematic taxonomy and DNA molecular sequencing， it was identified as Penicilliopsis clavariaeformis Solms， a new record species in the Chinese mainland. A variety of culture media were selected for culturing the strain and its morphological characteristics were observed.

Keywords Chinese mainland； New record species； Penicilliopsis clavariaeformis

擬青霉屬真菌是蟲生真菌中的重要類群，現記錄約50種，其中許多是重要的害蟲自然控制因子，有些是害蟲生物防治的重要材料。

Penicilliopsis clavariaeformis是Penicilliopsis pesudocordyceps的無性型，Penicilliopsis pesudocordyceps的全型是Pesudocordyceps seminicola[1]。臺灣收集到的Pesudocordyceps seminicola在自然生長的成熟子座上發現了子囊孢子。Penicilliopsis clavariaeformis曾在印度的紅樹林采集到，并通過鹽堿性實驗表明其具有耐鹽堿性，可調節碳代謝，在糖酵解、磷酸戊糖途徑中具有重要作用[2]。Penicilliopsis clavariaeformis結晶純化可得到代謝產物penicilliopsin，該代謝產物是一種橘黃色的色素物質，分離提取得到醌茜素或大黃素[3，4]，這兩種物質具有抗抑郁或抗腫瘤活性[5-9]。

2016年作者在山東進行水生、耐鹽中藥資源普查時發現一株擬青霉屬真菌，寄生于君遷子的種子上，形成珊瑚狀的子實體，經過人工培養和分子鑒定，確定其為珊瑚擬青霉。該真菌曾于2002年在中國臺灣報道過[1]，本研究為首次在中國大陸報道，君遷子種子為珊瑚擬青霉新寄主。本試驗使用不同的固體培養基對珊瑚擬青霉菌進行初步優化，通過人工培養、系統分類學研究及DNA分子鑒定對該真菌形態進行了詳細描述，為今后進一步研究珊瑚擬青霉的抗抑郁和抗腫瘤活性及開發相應的微生物菌劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試樣品 珊瑚擬青霉從君遷子種子中分離、純化得到，采于濟南市佛慧山，由山東中醫藥大學徐凌川教授鑒定。標本保存于中國科學院微生物研究所中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC：14129。

1.1.2 試驗儀器 PH100-DB500U數碼生物顯微鏡（鳳凰光學）；SUPRATM55熱場掃描電子顯微鏡（德國蔡司）；PCR反應擴增儀（加拿大BBI公司）；Blospin植物基因組DNA提取試劑盒。

1.2 試驗方法

1.2.1 固體培養基的制備 （1）察氏酵母膏瓊脂培養基：硝酸鈉 0.9 g；氯化鉀 0.15 g；硫酸鎂 0.15 g；硫酸亞鐵 0.03 g；酵母 1.5 g；磷酸二氫鉀 0.3 g；蔗糖 9 g；瓊脂 6 g；蒸餾水 300 mL；121℃滅菌40 min。

（2）燕麥瓊脂培養基：燕麥 12 g；葡萄糖 6 g；蔗糖 3 g；蛋白胨 0.6 g；硫酸鎂 0.15 g；磷酸二氫鉀 0.3 g；瓊脂 6 g；蒸餾水 300 mL；121℃滅菌40 min。

（3） 麥芽汁瓊脂培養基：麥芽汁 20 g；蛋白胨 0.3 g；葡萄糖 6 g；瓊脂 6 g；蒸餾水 300 mL；121℃滅菌40 min。

（4）25%甘油硝酸鹽瓊脂培養基：硝酸鈉 0.9 g；氯化鉀 0.15 g；硫酸鎂 0.15 g；硫酸亞鐵 0.03 g；酵母 1.5 g；磷酸二氫鉀 0.3 g；甘油 78 mL；瓊脂 6 g；蒸餾水 300 mL；121℃滅菌40 min。

1.2.2 光學顯微鏡觀察 從25℃培養7 d的四種固體培養基中分別挑取少量的菌絲置于顯微鏡下觀察，以菌落生長的快慢、大小、濃密程度、顏色、質地和產孢結構及分生孢子梗（分支狀況，簡單，復雜，長短）的形態特征（幾輪生、大小）作為鑒別主要依據。

1.2.3 掃描電鏡（SEM）觀察 取少量在燕麥培養基中25℃培養7 d的菌絲，采用冷凍干燥法干燥，用液氮研磨成粉末作為樣品，將少量菌絲樣品置于標本托上，雙面膠固定，噴金10 min，采用熱掃描電鏡觀察珊瑚擬青霉菌絲及孢子形態特征。

1.2.4 分子鑒定 用Blospin植物基因組DNA試劑盒提取菌株總DNA，利用通用引物ITS1/ITS4 PCR擴增菌株ITS序列，通用引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴增反應體系：2×Taq master mix 25 μL、DNA模板4 μL、ITS1引物 2 μL （2.5 μmol/L）、ITS4引物 2 μL （2.5 μmol/L）、ddH2O 17 μL。擴增程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 mim，35個循環；72℃ 10 min，產物于-4℃冰箱保存。取PCR產物5 μL、EB染液3 μL，利用濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將檢測正確的PCR擴增產物送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

2 結果與分析

2.1 珊瑚擬青霉在固體培養基的形態特征

在察氏酵母培養基上，25℃培養7 d菌落直徑達6.5～7.0 cm，菌落中心有白色絨毛，四周灰白色，彌漫到整個培養基邊緣，背面黃褐色，子座量少而短，米白色；14 d后整個培養皿長滿棒狀子座，長0.5～1.5 mm，米白色（細小）與淡橄欖綠色（粗大長滿孢子）相間分布，生長較濃密，孢子大量分布在子座上部及菌落表面。

在燕麥培養基上，25℃培養7 d后菌落直徑6.0～7.0 cm，正面棕黃色，背部深黃色。子座直徑0.1～0.3 mm，長度1.5～6.0 mm，帚狀分支或棒狀，子實體黃色，尖端淡黃色，生長相對濃密。14 d后菌落彌漫到培養基邊緣，柔軟光滑，圓鋸齒狀，子座分支或不分支，不規則軸向生長，新鮮時硫黃色，干燥后變橄欖綠色，背面黃褐色。孢子分布在整個菌落和子座表面。

在25%甘油硝酸鹽培養基上，25℃培養7 d菌落直徑達4.0～5.0 cm，正面灰白色，背部黃褐色。中心點有少量灰白色細小棒狀子座，子座周圍密布灰白色的絨毛。14 d后中心點附近灰白色菌絲濃密，子座長0.1～0.8 mm，直徑0.1 mm，菌落彌漫到培養基邊緣，呈灰綠色。

在麥芽培養基上，菌落和子座特征與在燕麥培養基上基本相似。

由于燕麥和麥芽都屬于糧食類，所以又選用了8種其他常見糧食作為原料培養該真菌并觀察其生長狀況。結果表明選用糧食作為主要碳源，菌絲生長差異不大，且有關研究表明該菌在燕麥培養基中培養6周能產生有性型子囊孢子[1]，所以為了保證有一定菌絲量同時可能發現子囊孢子，仍然選擇燕麥作為主要碳源。

2.2 珊瑚擬青霉的形態特征

野生珊瑚擬青霉棒狀子座直徑0.1～0.2 mm，長度1.0～7.0 mm，橄欖綠色（圖1A）。

利用光學顯微鏡觀察燕麥培養基中珊瑚擬青霉的形態結構發現產孢結構由菌柄、小枝、梗基組成。菌柄黃褐色，圓柱形，光滑，分支或不分支，5.0～6.0 μm。每個菌柄有2～3個小枝，橄欖綠色，短棒狀或筒狀，6～15 μm。每個小枝上有3～5個梗基，棒狀，光滑，頂部有微小的孢子，5～14 μm（圖1B）。每個梗基上有5～10個瓶梗，緊密，淡黃色，長筒狀，3～15 μm。分生孢子由上到下產生，淡黃色到橄欖綠色，卵圓形（4.32 μm ×7.50 μm）到長橢圓形（3.27 μm × 7.70 μm），光滑或稍粗糙（圖1 C）。

菌絲透明或半透明，光滑，直徑4-7 μm，掃帚狀，對稱，有明顯的分隔（圖1D）。分生孢子梗緊密、光滑，產孢結構帚狀二輪生或者多輪生，孢子梗上有無色或淡黃色的寬卵形或長卵形分生孢子，光滑或稍粗糙，單個排列（圖1B）。

掃描電鏡下珊瑚擬青霉子座形態光滑或稍微皺縮，密集成簇分布，粗細大致均勻，表面有明顯的分隔，直徑約4～6 μm（圖1E）。大量分生孢子緊貼在菌絲上，極面觀長橢圓形或寬橢圓形，赤道面觀近球形。表面皺縮，大小約（6.5～9.5）μm ×（3.5～5.5）μm，形態飽滿，兩端較尖（圖1F）。

2.3 序列拼接和去除低質量區后ITS堿基序列

將本試驗所得的序列利用Blast進行比對，結果顯示菌株與Penicilliopsis clavariaeformis Solms同源率為99%，結合形態觀察與鑒別，確定該菌株是珊瑚擬青霉。

3 討論與結論

本研究通過系統分類學及DNA分子鑒定方法確定該株擬青霉真菌為中國大陸新記錄種——珊瑚擬青霉。產孢結構由菌柄、小枝、梗基組成。分生孢子由上到下產生，淡黃色到橄欖綠色，卵圓形（4.3 μm×7.5 μm）到長橢圓形（3.3 μm×7.7 μm），光滑或稍粗糙，菌絲透明或半透明，產孢結構帚狀二輪生或者多輪生，標本與Samson 等[10]的描述基本一致。產孢結構為鑒定珊瑚擬青霉無性型的主要特征，Pesudocordyceps，Clavariaeformis，Sarophorum和Stilbodendron也有相似的產孢結構，二輪生或多輪生[1]。我們在野生狀態下和人工培養的過程中均未發現有性型，關于珊瑚擬青霉有性型的人工培養需作進一步的研究。已報道的珊瑚擬青霉的寄主都是柿子屬的柿子，因此君遷子的種子為新寄主。另外，文獻資料沒有關于君遷子種子的藥用記載，我們將進一步研究珊瑚擬青霉的液體發酵最優化生長條件、藥理作用及新寄主君遷子種子的藥用價值。因此，本研究為珊瑚擬青霉的綜合開發利用提供了科學依據。

參 考 文 獻：

[1] Hsieh H M， Ju Y M. Penicilliopsis pseudocordyceps， the holomorph of Pseudocordyceps seminicola， and notes on Penicilliopsis clavariaeformis[J]. Mycologia， 2002， 94（3）：539-544.

[2] Kashyap P L， Rai A， Singh R， et al. Deciphering the salinity adaptation mechanism in Penicilliopsis clavariiformis AP， a rare salt tolerant fungus from mangrove[J]. Journal Basic Microbiolgy， 2016， 56（7）：779-791.

[3] Shibata S， Shoji J， Ohta A， et al. Metabolic products of fungi. XI. some observation on the occurrence of skyrin and rugulosin in mold metabolites， with a reference to structural relationship between penicilliopsin and skyrin[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin， 1957， 5（4）：380-382.

[4] Oxford A E， Raistrick H. Studies in the biochemistry of micro-organisms： penicilliopsin， the colouring matter of Penicilliopsis clavariaeformis Solms-Laubach[J]. Biochemical Journal， 1940， 34（6）：790-803.

[5] 孟令旗， 劉暢， 孫虎男， 等. 醌茜素對人肺癌A549細胞增殖、凋亡的影響及初步機制研究[J]. 中國藥理學通報， 2016，32（11）：1625-1626.

[6] 李珂， 周瑜， 張盛， 等. 蛋白激酶CK2抑制劑-醌茜素在非小細胞肺癌中的抗腫瘤作用[J]. 中國醫院藥學雜志， 2016（17）：1460-1465.

[7] 劉靜， 王麗. 大黃素的研究進展[J]. 中國藥房， 2014（35）：3351-3354.

[8] 劉晗， 高云. 大黃素藥理作用的分子機制研究進展[J]. 中國藥理學通報， 2009， 25（12）：1552-1555.

[9] 丁艷. 大黃素藥理作用研究進展[C]//第十屆全國中藥藥理學術會議論文集.2007.

[10]Samson R A， Seifert K A. The ascomycete genus penicilliopsis and its anamorphs[C]//Samson R A， Pitt J I. Advances in Penicillium and Aspergillus Systematics. Boston：Springer， 1986， 102：397-428.