一株高拮抗活性菌株的鑒定及其抗菌活性缺失突變體的獲得
2018-10-22 07:01:10牟蕾衣靜莉李星志王虹張志劉愛新
山東農業科學 2018年7期
牟蕾 衣靜莉 李星志 王虹 張志 劉愛新
摘要：本研究以黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）和青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）為指示菌，從大豆植物根際土壤中篩選到一株拮抗活性較高的菌株（D-7），經RecA基因序列分析，鑒定其為新洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cenocepacia）。經PCR檢測，該菌株不存在毒性基因BCESM（esmR）和cblA。致病性分析發現該菌株對苜蓿幼苗和洋蔥沒有致病性。為了解該菌株的抗菌物質合成相關基因，利用Tn5轉座子突變法構建菌株D-7的突變體庫，并篩選獲得10株對黃瓜枯萎病菌抗菌活性減弱的突變體。對各突變株插入位點分析發現，其中5個突變株的Tn5轉座子插入到同一基因，該基因編碼葡萄糖抑制的分裂蛋白A（Glucose-inhibited division protein A， GidA），其余5株突變體的插入位點分別位于不同的基因上，編碼的蛋白包括糖基轉移酶（Glycosyl transferase）、Ⅱ型分泌系統蛋白（type Ⅱ secretion system protein）等，表明菌株D-7的抗真菌能力有多個基因參與。
關鍵詞：新洋蔥伯克霍爾德氏菌；拮抗活性；突變基因
中圖分類號：S182文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）07-0126-07
Abstract A bacteria strain D-7 was isolated from soybean rhizosphere soil and showed high anti-microbial activity to plant pathogenic fungi and bacteria， such as Fusarium oxysporum and Ralstonia solanacearum. The strain was identified to be Burkholderia cenocepacia based on RecA gene sequence and phylogenetic analysis. Specific PCR was constructed to amplify virulence genes， such as BCESM （esmR） and cblA， and the results showed the strain D-7 did not have the two genes. It also had no pathogenicity to alfalfa and onion. In order to understand the genes related to antibacterial substances of the strain D-7， a random mutant library was constructed using Tn5 transposon mutation method， and 10 mutants with reduced antimicrobial activity to Fusarium oxysporum were obtained. By the mutant insertion site analysis， we found that the Tn5 transposon in 5 mutants were inserted into the same gene， which encoded glucose-inhibited division protein A （GidA）， while the insertion sites of the remaining 5 mutants were located on different genes， and the encoded proteins included glycosyl transferase， typeⅡ secretion system protein and so on. It indicated that there were multiple genes involved in the antifungal activity of strain D-7 .
Keywords Burkholderia cenocepacia； Antimicrobial activity； Mutant gene
洋蔥伯克氏菌群（Burkholderia cepacia complex，簡稱Bcc）在自然環境中分布十分廣泛，包括水、土壤和植物根際等[1， 2]。Bcc是常見的植物根際促生細菌，具有生物固氮[3]、生物修復[4]和植物促生[5]等功能。Bcc對多種植物真菌病害如腐霉病、立枯病和枯萎病等具有明顯的防治效果[6]。任嘉紅等[7]發現，拮抗細菌吡咯伯克霍爾德氏菌（B. pyrrocinia）JK-SH007的抗菌粗蛋白可明顯抑制金黃殼囊孢、擬莖點霉、七葉樹殼梭孢3種楊樹潰瘍病病原真菌的生長。然而，該屬的部分菌株也是人體的條件致病菌[8，9]，因此生產上直接利用活體菌株存在潛在的風險，目前對于洋蔥伯克霍爾德氏菌的研究主要集中在抗菌物質的活性成分分析及合成相關基因上。
RecA基因在Bcc菌株不同基因型以及同一基因型間的相似性極高，不同基因型間相似性達94%～95%，而在同一基因型中的不同Bcc菌株的相似性則高達98%～99%，對長度為1 041 bp的RecA基因的陽性克隆擴增率一直很高，基于RecA基因構建的系統進化樹的聚類分析能夠很好地區分Bcc菌株的各個種[10]。
洋蔥伯克霍爾德氏菌致病因子（B. cepacia epidemic strain marker，BCESM）和電纜式菌毛及相關黏附素（cable pili & adhesion， cblA）是Bcc臨床菌株與人體致病菌相關的兩個毒力基因[11，12]，常被作為篩選人體條件致病菌的重要標志。BCESM基因中存在一個834 bp的開放閱讀框，即esmR[13]，是Bcc菌株中發現的第一個毒力基因，與Bcc菌株的流行致病有關，因此該基因被認為可以用于初步區分致病菌株與非致病菌株。cblA基因是另一個用來鑒定致病性菌株的毒力基因，該基因存在于大多數流行致病菌株中，編碼大型電纜式菌毛，促使菌體粘附呼吸器官[14，15]，因此認為無cblA基因的Bcc菌株無法粘附人體，從而缺乏致病力。
本實驗室前期從大豆根際土壤中分離到一株對多種植物病原真菌、細菌和卵菌表現出良好抗菌活性的菌株（D-7），經過RecA基因分析，鑒定其為新洋蔥伯克霍爾德氏菌。為了解該菌株的抗菌合成相關基因，采用Tn5轉座系統對菌株D-7進行隨機插入突變，獲得多株對黃瓜枯萎病菌抗性減弱的突變體并通過質粒拯救技術對相關基因進行了分析，為進一步了解菌株的抗菌物質合成相關基因提供了依據。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
1.1.1 供試菌株、質粒和試劑盒 本研究所用的菌株、質粒與試劑盒及其來源見表1。
1.1.2 培養基 植物根際菌株及突變菌株的篩選用NA培養基，電轉后恢復菌株生長用SOC培養基，真菌培養及抗菌作用分析用PDA培養基，大腸桿菌的培養用LA培養基。
1.2 試驗方法
1.2.1 菌株D-7抑菌活性測定 菌株D-7在NA培養基中28℃培養2 d，用無菌水洗滌收集菌體，經稀釋制成OD600=1的菌懸液。吸取10 μL菌懸液，接種于PDA固體培養基中央，待菌液充分吸收后，置于28℃恒溫培養箱培養48 h備用。
對黃瓜枯萎病菌和青枯勞爾氏菌的抑菌活性測定采用懸浮液噴霧法：用無菌水分別將黃瓜枯萎病菌和青枯勞爾氏菌配成106 cfu/mL的孢子懸浮液和菌懸液，用1 mL孢子懸浮液和1 mL菌懸液分別對上述培養48 h的PDA培養基均勻噴霧處理，繼續在25℃培養2 d，觀察記錄抑菌圈半徑大小。對姜莖基腐病菌、禾谷鐮孢菌和立枯絲核菌的抑菌活性測定采用菌絲塊接種法[16]：將直徑5 mm的菌餅分別移接到上述培養48 h的細菌菌落兩側，25℃繼續培養2～5 d后，觀察記錄抑菌圈半徑大小。每處理重復3次。
1.2.2 菌株D-7種的鑒定 采用CTAB法提取菌株D-7基因組DNA，利用通用引物RecA1和RecA2[10]（表2）擴增RecA序列。
50 μL PCR 擴增體系包含：10 μL 10×Primer Star buffer，4 μL dNTP Mixture（2.5 μmol/L），2 μL正向引物（10 μmol/L），2 μL反向引物（10 μmol/L），1 μL Primer Star HS DNA polymerase（5 U/μL），2 μL DNA模板（100 ng/μL），29 μL ddH2O。RecA擴增程序為：95℃ 5 min；95℃ 40 s，56℃ 40 s，72℃ 50 s，30個循環；72℃ 10 min，4℃保存。取擴增產物3 μL進行電泳檢測。
將經電泳檢測片段大小正確的PCR產物送至生工生物公司（上海）測序，將測序所得的RecA基因序列在GenBank中進行BLASTN比較分析，從GenBank數據庫中下載與目的序列相似性較大的菌株的RecA 序列，鑒定各菌株所屬種類；對其中鑒定為伯克氏菌的菌株用RecA序列進一步進行系統進化分析，利用 MEGA 6.06 軟件以Neighbor-Joining計算方式生成系統發育進化樹。
1.2.3 菌株毒性基因及對植物安全性檢測 由于伯克氏菌的某些菌株是人體條件致病菌，為明確菌株D-7的安全性，從三個方面對菌株D-7的毒性進行分析。
毒性基因檢測：用洋蔥伯克氏菌致病因子BCESM的特異性引物BCESM1/BCESM2和cblA毒力基因的特異性檢測引物cblA1/cblA2分別進行PCR擴增，擴增體系及程序同1.2.2，擴增引物及退火溫度見表2。
菌株D-7對苜蓿的毒力測定：苜蓿幼苗常作為生物模型用來評估Bcc菌株的毒力，參照Bergmann等[17]方法將苜蓿種子進行處理，待2片子葉展開時，用無菌針頭刺傷苜蓿幼苗的子葉表面，取培養好的菌懸液10 μL （1×106 cfu/mL）針刺接種于苜蓿幼苗的子葉傷口中，每株幼苗接種一片子葉，每處理重復3次，每重復接種10株幼苗，以同濃度洋蔥伯克氏菌LMG1222菌液處理作為陽性對照，生理鹽水處理為陰性對照。將處理好的苜蓿幼苗置于37℃的光/暗交替（12 h/12 h）的培養箱中，6 d后觀察并記錄發病情況。
D-7菌株在洋蔥莖上的致病性試驗：挑選大小適中、新鮮健康的洋蔥作為供試材料，取5 μL、濃度約為1×107 cfu/mL菌液針刺接種于洋蔥鱗莖，每處理重復3次，以同濃度洋蔥伯克氏菌LMG1222菌液處理作為陽性對照，以生理鹽水處理為陰性對照。將處理后的洋蔥鱗莖置于26℃培養箱中。按時觀察并記錄洋蔥的發病情況。
1.2.4 菌株突變體的篩選鑒定 參照文獻[18]制備菌株D-7的感受態細胞，吸取0.5 μL EZ-Tn5TM
挑取單菌落轉移至不含抗生素的PDA平板上，28℃培養2 d，噴施黃瓜枯萎病菌孢子懸浮液（1×106 cfu/mL），28℃繼續培養4 d，挑選抑菌能力減弱或缺失的突變體，并保存備用。
突變體驗證：對獲得的突變株在28℃、NA培養基中培養，參照CTAB法提取突變體基因組DNA，以引物R6KF1/KanR對轉座子內部的特異性序列（EZ-Tn5）進行PCR擴增，所用引物及其相應條件見表2，擴增體系及程序同1.2.2。
1.2.5 質粒拯救法鑒定側翼序列 采用CTAB法提取突變體基因組DNA，根據EZ-Tn5轉座子序列上的多克隆酶切位點（圖1），選擇限制性內切酶EcoR Ⅰ進行酶切。酶切體系包含：突變體基因組DNA 5 μL（100 ng/μL），EcoRⅠ1 μL（20 U/μL），10 × H Buffer 2 μL，ddH2O補足至20 μL。將各組分混勻后，37℃恒溫水浴鍋中酶切2 h。
酶切產物純化參照Biomiga PCR產物純化試劑盒（DC3511/DC3514）說明進行。對純化的酶切產物進行自連接，10 μL連接體系包括：純化酶切產物8 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，10 × T4 DNA Ligase Buffer（350 U/μL）1 μL，將各組分混勻后，16℃恒溫水浴鍋中連接4 h，然后轉化至E. coli Transfor Max EC100D pir+，篩選陽性克隆，送上海生工生物公司進行測序。
2 結果與分析
2.1 菌株D-7抑菌能力測定
抑菌試驗結果表明，菌株D-7對多種植物病原真菌、細菌、卵菌都表現出明顯的拮抗活性（圖2）。對不同菌株抑菌能力測定發現，菌株D-7對青枯勞爾氏菌、立枯絲核菌的拮抗效果最好，抑菌圈半徑均大于1.5 cm，對黃瓜枯萎病菌、禾谷鐮孢菌、姜莖基腐病菌的拮抗活性較差，抑菌半徑小于1.0 cm（圖3）。
2.2 菌株D-7種的鑒定
以菌株D-7基因組DNA為模板，利用通用引物RecA1和RecA2擴增RecA基因，得到約1.0 kb左右的產物。利用系統進化分析軟件MEGA 6.06對菌株D-7進行系統進化分析，發現菌株D-7與B. cenocepacia DQ664181和B. cenocepacia NC_008060.1位于同一個分支（圖4），表明菌株D-7屬于新洋蔥伯克霍爾德氏菌，菌株D-7 RecA基因在NCBI中的登錄號為MF964231。
2.3 菌株D-7安全性檢測
以菌株D-7基因組DNA為模板，利用BCESM和cblA基因特異性檢測引物進行PCR擴增發現，在菌株D-7中兩對引物的檢測結果均為陰性，而洋蔥伯克氏菌LMG1222均出現目的條帶（圖5）。
用菌株D-7的菌懸液處理子葉展開的苜蓿幼苗發現，經菌株D-7和生理鹽水處理6 d后，苜蓿幼苗的子葉和幼莖未有明顯變化（圖6a，圖6b），但用洋蔥伯克氏菌LMG1222處理的苜蓿幼苗在接種點附近出現壞死、子葉明顯黃化等現象，部分幼苗還表現根莖變形、扭曲等病理反應（圖6c）。
洋蔥伯克氏菌最初分離自腐爛的洋蔥鱗莖，因此對洋蔥的致病力進行了測定。接種菌液5 d后，接種洋蔥伯克氏菌LMG1222的洋蔥鱗莖在接種點附近出現黃色水漬狀壞死斑，接種7 d后，壞死斑擴大，且洋蔥組織變軟、腐爛，散發難聞氣味；而接種菌株D-7和生理鹽水的洋蔥鱗莖，5 d后僅在接種點處出現透明狀接種斑，且接種7 d后接種斑未見擴大，洋蔥組織無腐爛癥狀（圖7）。以上結果表明，菌株D-7不是洋蔥的致病菌。
2.4 菌株D-7抑菌能力減弱突變體的篩選鑒定
為分析菌株D-7對病原真菌的拮抗機制，以黃瓜枯萎病菌為指示菌，從菌株D-7的Tn5轉座子突變體庫中篩選到10株抑菌能力減弱的突變體，利用質粒拯救策略對突變體進行基因定位分析。序列分析結果表明，在10株抑菌活性減弱的突變體中，有5株突變體的突變位點位于同一個基因上，并且該基因與新洋蔥伯克霍爾德氏菌HI2424 GidA基因具有較高的同源性，核苷酸序列同源性為97%。其余5個突變體的突變位點分別位于不同的基因，包括N-乙酰谷氨酸合成酶基因、糖基轉移酶基因等，且與新洋蔥伯克霍爾德氏菌HI2424中相關基因的同源性均大于90%（表3），表明D-7對黃瓜枯萎病菌的抗菌活性有多個基因參與。
3 討論與結論
植物根際微生物群體存在多樣性，它們在植物病害防治、促進植物生長方面發揮了重要作用。Bcc菌群作為其中的重要類群之一，也顯示多種生物功能，包括產生抗菌物質、IAA和鐵載體等[19]。前期，我們從大豆根際土壤中篩選到一株對多種病原真菌、細菌、卵菌都有良好拮抗作用的菌株D-7，基于RecA的序列分析，將其鑒定為新洋蔥伯克霍爾德氏菌。BCESM和cblA是Bcc致病流行菌株中兩個特定的毒力基因，在非致病流行菌株中很少存在，被稱為流行菌株標記。本研究中我們發現，菌株D-7不存在毒性基因BCESM和cblA，并且對洋蔥和苜蓿沒有致病性。
明確菌株D-7合成的抗菌物質及其合成相關基因，對研究其抑菌作用機制并進一步開發新型殺菌劑具有重要意義。Wang等[20]研究發現，吡咯伯克霍爾德氏菌Lyc2中基因簇ocf編碼的一種環狀多肽Occidiofungin對拮抗多種病原真菌起關鍵作用。我們從D-7突變體庫中篩選到10株對黃瓜枯萎病菌拮抗活性減弱的突變體，序列分析發現，有5株突變體的突變位點位于GidA基因上，表明該基因對D-7的抑菌活性非常重要。其余5株突變體的插入位點位于不同的基因上，包括編碼蛋白糖基轉移酶、II型分泌系統蛋白等基因，有關這些基因與D-7產生抗菌物質之間的關系、作用特點等，尚需進行深入的研究。
參 考 文 獻：
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