鴨疫里默氏桿菌向大腸桿菌傳遞抗藥性的研究

林樹乾 秦炳燕 馮敏燕 李桂明 楊世發 趙增成 傅劍 黃中利

摘要：為了解細菌抗藥性的種間傳遞，本試驗將抗藥的鴨疫里默氏桿菌RA P3菌株和不抗藥的大腸桿菌標準株8099混合傳代培養，篩選傳代培養后出現的大腸桿菌抗藥菌株，之后對獲得的抗藥大腸桿菌菌株K-8099和大腸桿菌標準株8099及鴨疫里默氏桿菌RA P3菌株進行藥敏試驗和抗藥基因檢測。結果表明鴨疫里默氏桿菌RA P3的抗藥基因傳遞給了不抗藥的大腸桿菌標準株8099，且大腸桿菌抗藥株K-8099的抗藥水平顯著提高。說明在混合感染過程中，鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌的的抗藥性確實可以發生種間傳遞。

關鍵詞：鴨疫里默氏桿菌；大腸桿菌；混合傳代培養；抗藥性傳遞

中圖分類號：S852.61文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）07-0027-06

Abstract In order to know the interspecific drug-resistance transfer of bacteria， RA P3 strain from Riemerella anatipestifer with drug-resistance and E.coli standard strain 8099 sensitive to the antibiotics were selected for mixed subculture to screen out the appeared E.coli strain with drug-resistance. Then， we tested the drug sensitive and resistance gene in E.coli strain K-8099 with drug-resistance from mixed subculture， E.coli standard strain 8099 and RA P3 strain in the study. The results showed that the resistance gene from RA P3 strain was transfered into E.coli standard strain 8099， and the drug-resistance of E.coli strain K-8099 was significant improved. This study proved that interspecific drug resistance transfer could really happen between Riemerella anatipestifer and E.coli in the mixed infection process.

Keywords Riemerella anatipestifer； Escherichia coli； Mixed subculture；Drug-resistance transfer

鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌均為嚴重危害鴨養殖業的主要病原菌[1]。鴨疫里默氏桿菌對2～8周齡雛鴨危害性最大，發病率為5%～90%，死亡率高達90%[2]。大腸桿菌是造成家禽養殖業經濟損失最嚴重的病原體，也是禽肉加工中造成胴體報廢的主要原因，僅因為大腸桿菌敗血癥導致的胴體報廢率就達到43%[3]。大腸桿菌與鴨疫里默氏桿菌盡管有相似的形態，但屬于不同科屬，大腸桿菌為腸桿菌科大腸桿菌屬，鴨疫里默氏桿菌先后被列入莫拉氏菌屬、巴氏桿菌屬，1993年Segers等根據培養特性、16S rRNA序列和表型，建議將其獨立出來成為黃桿菌科下的鴨疫里默氏桿菌屬[4]。這兩種臨床上常見的致病菌，常常出現混合感染、繼發感染[5-7]。由于在養殖業中常常不合理地使用抗生素，這兩種菌的抗藥性和抗藥譜不斷擴大[8-11]。臨床上雖然在藥敏試驗的基礎上指導用藥，但實際治療效果往往不佳，這很可能是因為這兩種菌混合感染時其各自不同的抗藥性發生了種間傳遞，使得每種菌的抗藥性都增加，抗菌譜擴大，導致治療失敗。本研究將不抗藥的大腸桿菌菌株與抗藥的鴨疫里默氏桿菌菌株共同傳代培養，檢驗是否能篩選出抗藥大腸桿菌菌株，以期為細菌抗藥性的種間傳遞提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

鴨疫里默氏桿菌抗藥菌株（RA P3）是本實驗室從2014年山東地區鴨疫里默氏桿菌病死鴨的肝臟中分離所得；大腸桿菌標準株8099（EC 8099），購自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒、2×Power Taq PCR MasterMix、6×Loading Buffer、50×TAE電泳緩沖液（pH8.5），購自北京百泰克生物技術有限公司； DL2000 DNA Marker，購自北京天根生物技術有限公司；Regvlar Agarose G-10，購自Biowest公司；慶大霉素標準品、妥布霉素標準品、阿米卡星標準品、環丙沙星標準品、氧氟沙星標準品、諾氟沙星標準品，均購自中國藥品生物制品檢定所；藥敏試紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 儀器

手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；DHP-500電熱恒溫培養箱（北京市永光明醫療儀器廠）；數顯氣浴恒溫振蕩器（常州普天儀器制造有限公司）；JHT-系列凈化工作臺（濟南潔康凈化設備廠）； 311型 CO2 培養箱（Thermo Fisher）；PCR擴增儀；GenoSens 1800系列凝膠成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 RA P3和EC8099菌株的藥敏試驗 采用藥敏試紙片法（K-B法）[12]進行RA P3和EC 8099對3種氨基糖苷類（妥布霉素、慶大霉素、阿米卡星）和3種喹諾酮類（氧氟沙星、環丙沙星、諾氟沙星）共6種抗生素的藥敏試驗。取游標卡尺準確測量抑菌圈直徑，以沒有明顯肉眼可見物區域為抑菌圈邊緣。試驗時大腸桿菌接種在普通營養瓊脂中，鴨疫里默氏桿菌接種在含4%血清的TSA瓊脂中。

1.4.2 鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌混合培養 按照李翠等[13]的方法對RA P3和EC 8099進行體外混合傳代培養。第一代將5 μL用含4%血清的TSA培養基活化培養24 h的RA P3菌液接種到4 mL含4%血清的TSB 培養基中，37℃搖床培養14～18 h，剛見渾濁時，再將活化的5 μL大腸桿菌菌液加入到上述培養基中，繼續同樣條件混合培養12 h。以后各代除了用5 μL上一代混合培養12 h的菌液代替活化的5 μL大腸桿菌菌液外，其它程序和接種培養條件同第一代。共傳代50次。每一代皆吸取100 μL混合培養菌液，涂布于含4%血清的TSA平板，置CO2恒溫培養箱37℃培養9～12 h，觀察兩種菌的生長情況。

1.4.3 篩選抗藥性大腸桿菌菌株 每一次混合傳代培養12 h后，皆吸取100 μL混合培養菌液，分別涂布于含慶大霉素（4 μg/mL）、妥布霉素（4 μg/mL）、阿米卡星（16 μg/mL）、氧氟沙星（0.5 μg/mL）、環丙沙星（0.5 μg/mL）、諾氟沙星（1 μg/mL）的麥康凱抗性篩選板，置CO2恒溫培養箱37℃培養20～24 h。由于鴨疫里默氏桿菌在麥康凱平板上不生長，所以在麥康凱抗性板上生長的菌株即為抗藥的大腸桿菌菌株。上述各篩選板所含抗生素濃度，為歐洲藥敏試驗聯合委員會（EUCAST）2017歐盟藥敏試驗標準所列出的大腸桿菌對抗生素的耐受折點值。

1.4.4 抗藥大腸桿菌與EC 8099藥敏試驗的比較 先挑取在麥康凱抗性板上生長的菌落進行純化培養，之后利用藥敏試紙片法（K-B法）進行抗藥大腸桿菌與EC 8099對3種氨基糖苷類（妥布霉素、慶大霉素、阿米卡星）和3種喹諾酮類（氧氟沙星、環丙沙星、諾氟沙星）共6種抗生素的對比藥敏試驗。

1.4.5 抗藥大腸桿菌與EC 8099最低抑菌濃度的比較 根據藥敏試驗結果，采用試管雙倍稀釋法[12]，對EC 8099及抗藥大腸桿菌進行抗生素最低抑菌濃度（MIC）檢測。

1.4.6 抗藥基因檢測 上述試驗篩選得到的抗藥大腸桿菌耐受氨基糖苷類藥物，所以選取論文中已發表的氨基糖苷乙酰轉移酶基因aac6-Ⅰ[14]及aac3-Ⅱ[15]、氨基糖苷腺苷轉移酶基因aadA1[16]、氨基糖苷磷酸轉移酶基因aph（3′）-Ⅲ [17]的引物序列（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。通過PCR檢測RA P3、EC 8099及混合傳代后篩選到的抗藥大腸桿菌有無抗藥基因。各基因引物序列見表1。

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取RA P3、EC 8099及混合傳代后篩選到的抗藥大腸桿菌的基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系見表2。

PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環；最后72℃再延伸10 min。PCR擴增結束后的產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 RA P3和EC 8099藥敏測定結果

從表3可以看出，RA P3耐受這6種抗生素；而根據EUCAST 2017歐盟藥敏試驗標準，EC 8099對這6種抗生素皆敏感。

2.2 混合傳代培養

混合培養過程中，基本每一代都能得到如圖1所示的培養結果，奶油狀透明的小菌落為鴨疫里默氏桿菌，白色大菌落為大腸桿菌，兩者的菌落數量大體一致。

2.3 抗藥大腸桿菌篩選結果

在混合傳代培養后篩選抗藥菌株過程中，含環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的麥康凱抗性板上一直無菌落出現；含阿米卡星的麥康凱抗性板上在27代有單個菌落，含慶大霉素的麥康凱抗性板上36代有多個菌落，含妥布霉素的麥康凱抗性板上在37代有3個菌落（圖2）。挑取各個抗性板上的單個菌落繼續在相應抗性的麥康凱抗性板上傳代，僅第27代篩選得到的抗藥菌株可以在含阿米卡星抗性板上穩定生長，命名為大腸桿菌K-8099（EC K-8099）。

2.4 EC 8099與EC K-8099藥敏試驗結果比較

從圖3、4可以直觀看出，EC K-8099菌株獲得對3種氨基糖苷類抗生素的抗藥性，但仍然不耐受3種喹諾酮類藥物。

2.5 EC 8099與EC K-8099最低抑菌濃度的比較

從表4可以看出，EC K-8099對三種氨基糖苷類抗生素的MIC顯著高于EC 8099。

2.6 抗藥基因檢測

如圖5、6所示，從RA P3菌株及大腸桿菌抗藥菌株K-8099檢測到了一條486 bp的條帶，為aac6-Ⅰ基因，但未檢測到其他基因。大腸桿菌標準株8099未檢測到任何抗藥基因。

3 討論與結論

隨著全球細菌抗藥性問題越來越嚴重，人們一直在研究探索抗藥性產生的機理。目前認為細菌的抗藥性來源包括兩個途徑：一個是細菌自身基因突變產生新的抗藥基因。這種突變主要發生于染色體DNA，質粒DNA或轉座子DNA也可發生，而且除結構基因外的某些調節基因突變也可導致細菌抗藥性的產生。但這類自發突變的機率很小，約為 10-6～10-8，更多的是由理化因素誘發突變而產生抗藥基因。由于在不穩定的環境因素選擇下，細菌通常很難形成穩定的抗藥性菌株，因此，自身基因突變并不是造成如今細菌抗藥局面的主要原因[18]。捕獲外源抗藥基因是細菌獲得抗藥性的另一個重要途徑。外源性抗藥基因可以位于其染色體片段上，也可由質粒攜帶[19]。在外界環境誘導下，質粒攜帶的這些可移動的遺傳因子可在不同的種屬間傳遞；還可通過轉座子[20，21]或整合子/基因盒[22-25]將位于染色體上的抗藥基因進行種屬間傳遞，引起遺傳信息重新排列。這樣不但傳遞了抗藥性，而且更容易產生多重抗藥菌株。細菌由這種捕獲方式獲得抗藥性的機率高，是引起抗藥性的主要原因[26，27]。

鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌的培養條件相差很大，使用同一種培養基培養兩種菌，若大腸桿菌具有生長優勢，則會抑制鴨疫里默氏桿菌的生長。本實驗室通過多次摸索，首先確定了在連續傳代情況下兩種菌能共同生長的培養條件，并建立了體外混合培養及重新分離這兩種細菌的方法[13]。

篩選抗藥性大腸桿菌試驗中，在慶大霉素、妥布霉素及阿米卡星麥康凱抗性板上均篩選到了單個菌落；讓這些單個菌落繼續在相應抗性板上傳代，其中僅阿米卡星抗性板上的菌落能穩定遺傳。說明捕獲的抗藥性，未必能穩定遺傳。

本試驗結果表明，篩選獲得的大腸桿菌抗藥菌株K-8099獲得了氨基糖苷乙酰轉移酶基因aac6-Ⅰ，且對氨基糖苷類的妥布霉素、慶大霉素和阿米卡星的最低抑菌濃度較大腸桿菌標準株8099顯著增加。氨基糖苷乙酰轉移酶基因aac6-Ⅰ基因存在于RA P3菌株的染色體DNA中，而在大腸桿菌標準株8099中未檢測到，由此判斷該抗藥基因是由鴨疫里默氏桿菌向大腸桿菌傳遞而來，可能是通過轉座子或者整合子在這兩種不同種屬的細菌間進行基因傳遞。

參 考 文 獻：

[1] Saif Y M， Bames H J， Glisson J R， et al. Diseases of poultry[M].11th edition. America：Iowa State University Press， 2003： 892-893.

[2] 卡爾尼克B W. 禽病學[M]. 高福， 劉文軍， 譯. 第9版. 北京： 中國農業出版社， 1991： 153-157.

[3] Yogaratnam V. Analysis of the causes of high rates of carcase rejection at a poultry processing plant[J]. Vet. Rec.， 1995， 137（9）： 215-217.

[4] Segers P， Mannheim W， Vancanneyt M， et al. Riemerella an-atipestifer gen. nov. ， comb. nov. ， the causative agent of septicemia anserum exsudativa， and its phylogenetic affiliation within the Flavobacterium-Cytophaga rRNA homology group[J]. Int. J.Syst. Bacteriol.， 1993， 43（4）： 768-776.

[5] 徐忠新. 鵝的鴨疫里默氏菌與大腸桿菌混合感染的診治[J]. 水禽世界， 2010（4）： 34-35.

[6] 黃仁美， 蘇建義. 小鴨傳染性漿膜炎與大腸桿菌病并發診治的探討[J]. 福建畜牧獸醫， 2008，30（2）：21-22.

[7] 夏艷勛， 趙傳壁. 鴨疫里默氏桿菌和鴨大腸桿菌的診斷及藥敏試驗分析[J]. 鄭州牧業工程高等專科學校學報， 2012， 32（2）： 27-28.

[8] Zhong C Y， Cheng A C， Wang M S， et al. Antibiotic susceptibility of Riemerella anatipestifer field isolates[J]. Avian Diseases， 2010， 53（4）： 601-607.

[9] 張濟培， 張小峰， 陳建紅， 等. 珠三角及鄰地鴨疫里默氏桿菌主要生物學特性的研究[J]. 中國預防獸醫學報， 2012， 34（2）： 100-103.

[10]劉海林， 武新國. 大腸桿菌的藥敏試驗報告[J]. 當代畜牧， 2014（32）： 70-71.

[11]馮敏燕，傅劍，楊世發，等.山東省雞源性大腸桿菌耐藥變化趨勢監測[J].中國獸醫學報，2017，37（2）：250-253.

[12]陳東科，孫長貴.實用臨床微生物學檢驗與圖譜[M].北京：人民衛生出版社，2011：767-775.

[13]李翠，楊世發，林樹乾，等.鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌混合培養及重新分離方法初探[J].家禽科學，2016（4）：6-8.

[14]孫慧，雷戰，鄒金峰，等. 山東地區禽源致病性大腸桿菌氨基糖苷類藥物耐藥性及耐藥基因的檢測[J]. 中國獸醫學報，2011，31（9）：1279-1282.

[15]鐘建平，金法祥，王華鈞. 老年患者大腸埃希菌菌株親緣性分析[J]. 中華臨床感染病雜志，2009，2（6）：358-360.

[16]王元蘭，劉軍軍，邵穎，等. 源自合肥地區表觀健康雞的沙門氏菌耐藥性與血清型、基因型相關性分析[J]. 安徽農業大學學報，2013，40（4）：540-546.

[17]丁明東. 耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌中多種抗生素耐藥基因的觀察[J].氨基酸和生物資源，2013，35（2）：51-55.

[18]吳聰明， 陳杖榴. 細菌耐藥性擴散的機制[J]. 動物醫學進展， 2003， 24（4）： 6-11.

[19]Davies J， Smith D I. Plasmid-determined resistance to antimicrobial agents[J]. Annu. Rev. Microbiol.， 1978， 32：469-518.

[20]藍惠華.產ESBLs大腸埃希菌耐藥基因水平轉移元件的研究[D].合肥：安徽醫科大學，2017.

[21]魏楚洪. 佛山地區小兒肺炎鏈球菌臨床分布特征及耐藥性分析[J]. 臨床合理用藥雜志， 2017， 10（18）：83-85.

[22]Hall R M，Brookes D E， Stokes H W. Site-specific insertion of genes into integrons： role of the 59-base element and determination of the recombination cross-over point[J].Mol. Microbial.， 1991， 5（8）：1941-1959.

[23]Nevera J， Hochmannova J， Ptek M. An integron of class 1 is present on the plasmid pCG4 from Gram-positive bacterium Corynebacterium glutamicum[J]. FEMS Microbiology Letters， 1998，169（2）：391-395.

[24]杜艷，郭翀，胡瑩，等. 整合子介導的大腸埃希菌臨床菌株多重耐藥研究[J]. 臨床檢驗雜志，2005，23（2）：88-90.

[25]王娜. 整合子介導的豬源正常菌群大腸桿菌耐藥性研究[D].杭州：浙江大學，2006.

[26]Mobak K， Baggesen D L， Aarestrup F M， et al. An outbreak of multidrug-resistant， quinolone-resistant Salmonella enterica serotype typhimurium DT104[N]. New England Journal of Medicine， 1999， 341（19）： 1420.

[27]Feschenko V V， Lovett S T. Slipped misalignment mechanisms of deletion formation： analysis of deletion endpoints[J]. J.Mol. Biol.， 1998， 276（3）： 559-569.