醬油中生物胺的形成機制及其測定

王青華，范桂強，張咚咚

(1.天津科技大學 食品工程與生物技術學院 食品營養與安全教育部重點實驗室，天津 300457；2.衡水市食品藥品檢驗檢測中心，河北 衡水 053000)

生物胺是一類含氨基的低分子質量且具有一定生物活性的有機化合物的總稱，廣泛存在于多種食品中，尤其是魚類及其相關產品，酒類、肉類、干酪、豆制品及其他發酵制品中。組胺、酪胺、腐胺、尸胺、精胺、苯乙胺和色胺被認為是食物中最普遍的生物胺[1]。

食品中的生物胺由于其潛在的生理和毒性作用對人類健康產生了極大危害。如果攝入過量的生物胺會引起一系列的健康問題，會出現如頭痛、惡心、血壓不穩、心悸等癥狀，在各類生物胺中，普遍認為對人類健康危害最大的是組胺和酪胺[2,3]。

1 醬油中生物胺的形成

1.1 生物胺的生理作用

組胺在哺乳動物的腦部組織中，在充當過敏癥[4]、胃酸分泌[5,6]、神經傳遞介質化學調節劑方面起到很大的作用[7,8]。當食品中組胺含量較低時，該食品不會被認為存在健康風險；在體內，長期缺乏組胺和組胺過量都會引起神經和生理方面的功能失調。但當攝入量超過1000 mg/kg時，會直接導致食物中毒如干酪綜合癥等[9,10]，嚴重的會引起明顯的生理和毒性危害。組胺含量異常會出現明顯的功能失調癥狀如胃疾病、肥大細胞癥、骨髓性白血病等[11]。

酪胺，又名p-對羥基苯乙胺，據報道，攝入大量含酪胺的食品后會引起明顯的毒性作用[12]。還有文獻說明患有偏頭痛的病人攝入含有酪胺的食品后會加重偏頭痛的病情[13,14]。酪胺還會加速神經末梢血管收縮，剌激心律加快，增加血糖濃度。人體攝入酪胺超過100 mg會引起偏頭痛癥狀，超過1080 mg會引起嚴重的中毒性腫脹。

1.2 醬油中生物胺的形成機制

從世界范圍看，中國是醬油起源最早的國家，醬油是中國傳統的發酵型調味品，主要是由豆粕、面粉、麩皮和小麥等為原料，在多種微生物主要是曲霉屬真菌作用下發酵而成的。在醬油制作發酵過程中，在由米曲霉和大豆疫酶產生的蛋白酶的作用下，原料中的蛋白質被水解成小分子的肽類、氨基酸和氨類[15]。醬油特有的風味在發酵和老化過程中逐漸形成，同時形成了高含量的自由氨基酸，自由氨基酸的產生使醬油產生特有的風味，同時可能也是生物胺潛在的主要來源。

生物胺是醬油在長期發酵過程中非常容易產生的一類有害物質。生物胺主要是由微生物脫羧酶在輔酶5-磷酸吡哆醛的作用下，作用于相應的氨基酸，脫去羧基所形成的胺。生物胺的形成需要具備以下條件：存在可以分泌氨基酸脫羧酶的微生物；有相應氨基酸的存在；有利于相關微生物生長，可以提高相應脫羧酶活性的環境。

2 生物胺的檢測方法

目前，檢測生物胺的方法主要是高效液相色譜法、氣-質聯用法[16]、酶學測定法[17]等。其中最常用的是高效液相色譜法。由于高效液相色譜法較為成熟，可以同時測定一類物質的多種類物質的含量，本方法采用高效液相色譜方法同時測定最重要的2種生物胺——組胺和酪胺的含量。本研究測定了3種常見市售醬油中的組胺和酪胺含量，為消費者的飲食提供了一定的膳食指導。

2.1 實驗材料與方法

2.1.1 儀器設備

Agilent 1260液相色譜儀(配紫外檢測器) Agilent公司；渦旋混合器 美國Talboys公司；高速離心機 日立公司；分析天平。

2.1.2 試劑及材料

乙腈、丙酮、甲醇：均為色譜純；乙酸銨、氨水(25%)、NaHCO3、氫氧化鈉、高氯酸：均為分析純；丹磺酰氯、組胺和酪胺標準品：Sigma-Adrich公司，純度均大于99%；實驗用水：均為雙蒸水，并經 Milli-Q超純水處理。廚邦味極鮮醬油、廚邦蒸魚豉油、李錦記蒸魚豉油、欣和六月鮮：均購自衡水吉美超市。

2.2 實驗過程

2.2.1 樣品預處理

分別取2 mL醬油于10 mL離心管中，用0.4 mol/L高氯酸稀釋至刻度，置于渦旋混合器上混合5 min，待用[18]。

2.2.1.1 樣品衍生化

分別吸取0.1 mL樣液注入到螺帽瓶中，加入2 mol/L NaOH 0.2 mL溶液調節溶液pH值，飽和 NaHCO3溶液0.3 mL和丹磺酰氯丙酮溶液(10 mg/mL)1.0 mL，將上述混合物在40 ℃條件下于暗處攪拌30 min，然后加少量氨水使多余的丹磺酰氯沉淀，過濾，將上清液轉移到容量瓶中，用乙腈定容至5 mL，過0.45 μm濾膜后進行色譜分析。

2.2.1.2 標準儲備液的制備

稱取一定量的組胺和酪胺標準品，用 0.4 mol/L 高氯酸配制成濃度為 1 mg/mL 的組胺和酪胺標準溶液，放于冰箱中4 ℃保存，每周一配。精確稱取適量丹磺酰氯，用丙酮溶解并配制成濃度為 10 mg/mL的溶液，經過 0.45 μm 針頭微孔濾膜過濾器過濾后，于4 ℃冰箱中保存備用。

2.2.1.3 組胺和酪胺標準溶液的衍生化過程

配制濃度為5,20,50,100,200，500 μg/mL的組胺標準溶液和濃度為2,8,20,40,80，200 μg/mL的酪胺混合標準溶液，取0.1 mL含有不同濃度的組胺和酪胺的混標溶液，具體衍生過程同2.2.1.1。

2.2.2 色譜條件

色譜條件：Agilent 1100色譜儀，流動相為V(乙腈)∶V(乙酸銨)為80∶20，進行等度洗脫；流速：1 mL/min；色譜柱：Waters Nova-Pak C18(250 mm×4.6 mm) Column；配有紫外檢測器；檢測波長為254 nm，進樣量為20 μL，柱溫 為40 ℃。

2.3 結果與討論

2.3.1 色譜條件

實驗過程中選用了甲醇、乙腈、乙酸及乙酸胺等溶液搭配使用來選擇流動相，結果發現乙腈和乙酸銨搭配使用最為合適，本實驗之所以使用等度洗脫和梯度洗脫，是由于實驗中為了優化測定色譜條件，減少整個測定過程的時間，消除其他干擾物質的影響。

考察了柱溫對組胺和酪胺出峰的影響后發現柱溫變化時組分出峰順序沒有變化，但分析時間隨柱溫升高而縮短。

2.3.2 樣品提取

本實驗采用水、鹽酸、甲醇、正丁醇、丙酮、三氯乙酸、高氯酸等溶劑作為提取溶劑進行實驗，結果發現 0.4 mol/L高氯酸溶液提取效果較好，因此選用0.4 mol/L高氯酸溶液作為提取劑。

2.3.3 衍生化過程

本文選用了鄰苯二甲醛、 磺酰氯二甲胺偶氮苯、丹磺酰氯、異硫氰酸苯酯、熒光胺、氯甲酸(9-芴醇)甲酯作為衍生試劑，結果發現使用丹磺酰氯進行衍生效果很好，衍生方法也比較簡單。

由于生物胺在弱堿性條件下才能與丹磺酰氯發生反應， 因此樣品在衍生前先用氫氧化鈉溶液調節pH至中性，再用碳酸氫鈉溶液調節 pH至8.5～9.0。丹磺酰氯衍生在40 ℃條件下反應30 min。當衍生45，90，150 min實驗時，結果顯示在不同的衍生時間峰面積沒有明顯差異，因此，沒必要進行太長時間的衍生過程。

2.3.4 衍生物的穩定性

通過對 2 mg/L的標準品衍生物做穩定性試驗，發現放置在4 ℃、避光條件下，衍生物在2周內的峰面積變化不大，但第3周開始峰面積明顯降低。因此，衍生物在4 ℃、避光條件下，可保存2周。

2.3.5 標準工作曲線

將上述配制成一系列濃度梯度的組胺和酪胺的混合標準溶液分別進行進樣分析，在以上2種實驗條件下，分別進行色譜分析，分別以組胺和酪胺的色譜峰面積(Y)為縱坐標，以相應的濃度為縱坐標繪制標準曲線，結果表明在上述2種色譜條件下，組胺在5～500 μg/mL，酪胺在2～200 μg/mL的濃度范圍內均有良好的線性關系，線性回歸方程分別為：

組胺：Y=16.6560+25.1341X，相關系數為r=0.99999；酪胺：Y=296.7579+29.3575X，相關系數為r=0.99990。

其中，Y為生物胺的峰面積，X為衍生前對應的生物胺的濃度。由此可見，峰面積和生物胺濃度呈良好的線性相關性，測定結果良好可靠。

圖1 組胺和酪胺混標溶液液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of mixed histamine and tyramine solution

2.4 測得的結果

測定4種市售醬油中組胺和酪胺的含量，結果見表1。

表1 2種色譜條件下測得的醬油中組胺的含量Table 1 Determination of histamine in soy sauce under two chromatographic conditions

由表1可知，在市售常見的這4種醬油中，廚邦蒸魚豉油中酪胺的含量最高，酪胺的含量為713.54 μg/mL，欣和六月鮮醬油中組胺的含量最高，組胺的含量為522.28 μg/mL。因此，在食用醬油時，根據醬油的品牌和種類控制食用量，否則對人體健康會造成很大的危害。

2.5 加標回收實驗

為了進一步評價2種色譜條件下測定的準確度和精密度，本研究以廚邦味極鮮醬油為研究對象，在此樣品中分別添加組胺標準溶液和酪胺標準溶液，制成濃度分別為1000,400,200 μg/mL組胺和濃度分別為800，320，160 μg/mL的酪胺加標樣品進行加標回收實驗，結果見表2和表3。

表2 組胺的加標回收實驗Table 2 Recovery of histamine under different chromatographic conditions

表3 酪胺的加標回收實驗Table 3 Recovery of tyramine under different chromatographic conditions

由表2和表3可知，組胺的加標回收率在101.61%～112.82%之間，酪胺的加標回收率在104.12%～112.92%之間。

3 結論

該研究針對組胺和酪胺測定的液相色譜條件進行了優化，測定了常見的醬油中對人體危害最大的組胺和酪胺的含量，從而可以對不同人群的膳食指導做出一定的貢獻。關于食品中組胺的允許水平，我國規定了水產品中組胺的限量標準[19]，鮐鲹魚類不得高于1000 mg/kg，其他紅肉魚類不得高于300 mg/kg。然而上述大豆發酵制品、酸奶和啤酒食品中組胺的含量也可能會比較高，我國卻尚未做出相關的限量規定，應進一步完善和健全食品安全標準體系。