正交實驗法優化姜黃油及姜黃素提取工藝

羊青,王茂媛,晏小霞,王清隆,王建榮,王祝年

(中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，農業部華南作物基因資源與種質創制重點開放實驗室，海南 儋州 571737)

姜黃為姜科植物姜黃(CurcumalongaL.)的干燥根莖，產于我國四川、福建、云南等省區，東亞及東南亞地區廣泛栽培，為藥食同源植物，被稱為“21世紀的健康明星”，除了作為傳統藥物使用之外，還廣泛用作著色劑、調味品、香料及防腐劑。姜黃性味辛、苦、溫；歸心、脾、肝經，具有活血、散瘀、疏肝解郁的功效，可用于治療胸脅刺痛、閉經、風濕疼痛等[1]。姜黃中含有多種成分，主要為揮發油和姜黃素類化合物，此外還含有糖類、甾醇類等成分。姜黃揮發油為帶有芳香性氣味的油狀物質，主要成分為姜黃烯、芳姜黃酮等萜類物質，具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等功效[2-6]。姜黃的黃色物質為略帶酸性的酚類物質，是姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的混合體，稱為姜黃素，具有利膽保肝、降血脂、活血通經、抗生育、抗氧化、抗炎、免疫調節、抗腫瘤、抗艾滋病毒、抗動脈粥樣硬化、預防老年癡呆[7-12]等生理和藥理作用。姜黃揮發油的提取方法主要包括水蒸氣蒸餾法、有機溶劑萃取法、超臨界CO2流體萃取法等[13-15]，其中水蒸氣蒸餾法具有提取設備簡單，簡便易操作，對溶劑純度要求不高等優點，在工業生產上更為常用。姜黃素提取方法主要有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等[16-18]，其中以乙醇作為溶劑提取較為常用。本實驗應用正交實驗設計方法對常用的姜黃油和姜黃素的提取方法進行優化，提高姜黃中有效成分的提取效率。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

UV-2100紫外可見分光光度計、AY220分析天平 日本島津公司；XL-04A中藥材粉碎機 廣州金本機械設備有限公司；N-1001(2 L)立式旋轉蒸發器 上海愛朗儀器有限公司；DHG9035A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.1.2 試劑

實驗采用的姜黃采自海南省，由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所王祝年研究員鑒定為姜科植物姜黃的根莖。姜黃素標準品(HPLC≥98%，Sigma公司)，無水乙醇(分析純，廣州化工)。

1.2 方法

1.2.1 姜黃揮發油的提取

將收集的新鮮姜黃根莖洗凈烘干，并將其粉碎，過篩，干粉備用。參照《中國藥典》2010年版一部揮發油測定法(附錄XD甲法)，根據實驗設定的因素，分別提取揮發油。姜黃油得率按下式計算：姜黃油得率=讀取的揮發油體積(mL)/姜黃粉末質量(g)×100%。

1.2.2 姜黃素的提取

姜黃素不溶于水和乙醚，易溶于乙醇和冰醋酸，工業上常用乙醇提取，因此本文采用乙醇溶液提取法。

1.2.2.1 乙醇回流法

(1)準確稱量樣品，加入圓底燒瓶中，加入75%乙醇溶液，混勻；(2)連接好回流冷凝管，將水浴鍋溫度調至80 ℃，加熱1.5 h；(3)將提取液過濾，往圓底燒瓶中加入乙醇溶液，加熱1.5 h再提取2次，合并濾液，并用乙醇溶液清洗樣渣2～3次；(4)將濾液用乙醇溶液定容至250 mL，待測；(5)用分光光度計測定待測液吸光度值，并計算出姜黃素含量。姜黃素含量計算方法如下。

1.2.2.2 繪制標準曲線

將標準品配制成0.05 mg/mL 的75%乙醇溶液；

將標準品溶液與樣品溶液在300～500 nm處掃描，找出最高吸收峰，得出吸收波長為430 nm；

吸取不同量的標準品溶液，用75%乙醇稀釋，得濃度分別為0.8，1.0，2.0，4.0，8.0 μg/mL溶液，在分光光度計上分別測定吸光度。以標準曲線濃度與吸光度(兩者的關系見表1)分別為橫、縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y=0.1914x+0.01615，R2=0.9998，RSD=0.00815，其中x代表溶液濃度，y代表吸光度。

表1 相對濃度與吸光度的關系

1.2.2.3 樣品含量測定

取1 mL樣品溶液用75%乙醇稀釋至10 mL，得稀釋液1。取0.5 mL稀釋液1用75%乙醇稀釋至10 mL得稀釋液2，分光光度計測定其吸光度，用回歸方程計算出樣品濃度。姜黃素含量由下式計算得到：

1.3 姜黃揮發油提取正交實驗

根據單因素實驗結果，選取浸泡時間(A)、提取時間(B)、料液比(C)、粉碎粒度(D)為考察因素，以提取揮發油體積為考察指標，進行L9(34)正交實驗。每因素平行3次，RSD值均在數據可用范圍內，結果取平均值。

1.4 姜黃素提取正交實驗

根據單因素實驗結果，選取乙醇濃度(A)、提取時間(B)、提取次數(C)、粉碎粒度(D)為考察因素，以提取姜黃素提取率為考察指標，進行L9(34)正交實驗。每因素平行3次，RSD值均在數據可用范圍內，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 姜黃揮發油提取正交實驗

應用L9(34)正交實驗設計，優選最佳提取工藝參數。在單因素實驗結果的前提下，設置了正交實驗表，各因素水平見表2，實驗結果見表3。

表2 姜黃揮發油提取正交實驗因素水平表L9 (34)

表3 姜黃揮發油提取正交實驗結果

通過均值計算和極差分析得知，各因素對姜黃揮發油提取效果影響大小的順序為提取時間(B)>粉碎粒度(D)>料液比(C)>浸泡時間(A)。各因素水平的最佳組合為A1B2C1D3或A3B2C1D3。揮發油得率最高的組合為第8號實驗A3B2C1D3，該組合與L9(34)正交實驗結果一致。為了進一步驗證最佳工藝條件，對組合A1B2C1D3和A3B2C1D3再次進行驗證實驗。驗證結果發現2組實驗的揮發油得率基本一樣，由此可知A因素(浸泡時間)對實驗結果幾乎沒有影響，考慮到提取效率，故后續實驗方案藥材均不浸泡。最終確定最佳提取工藝為提取時間6.0 h，料液比1∶20(g/mL)，粉碎粒度80目。

2.2 姜黃素提取正交實驗

應用L9(34)正交實驗設計，優選最佳提取工藝參數。在單因素實驗結果的前提下，設置了正交實驗表，各因素水平見表4，實驗結果見表5。

表4 姜黃素提取正交實驗因素水平表L9(34)

表5 姜黃素提取正交實驗結果

通過均值計算和極差分析得知，各因素對姜黃素提取效果影響大小的順序為乙醇濃度(A)>粉碎粒度(D)>提取時間(B)>提取次數(C)。各因素水平的最佳組合為A2B3C2D3或A2B3C3D3，即乙醇濃度75%，提取時間2.0 h/次，提取次數2次或3次，粉碎粒度80目。因素C中，提取3次比提取2次姜黃素含量增加明顯，而提取4次與提取3次差異不大，為了縮短周期，決定提取3次，即選用A2B3C2D3組合。姜黃素含量最高的組合為第4號實驗A2B1C2D3，這與正交實驗計算出的最優組合A2B3C2D3僅有B因素每次提取時間存在差異。為了進一步驗證最佳工藝條件，在不改變因素A，C，D的條件下，對B因素的3個水平同時進行驗證，即對組合A2B1C2D3，A2B2C2D3，A2B3C2D3進行驗證。結果顯示，3個組合的姜黃素含量分別為3.20%，3.23%，3.24%，組合A2B3C2D3姜黃素含量最高，但其與A2B2C2D3組合結果差異不大，即每次提取1.5 h與提取2.0 h的結果差異不明顯。因此將每次提取時間確定為1.5 h，由此確定最佳工藝為乙醇濃度75%，提取時間1.5 h/次，提取次數3次，粉碎粒度80目。

3 結論

采用水蒸氣蒸餾法，應用L9(34)正交實驗設計，優化姜黃揮發油的提取工藝。根據預實驗結果，設置了4個影響因素，即提取時間、粉碎粒度、料液比和浸泡時間，并分別設置了3個水平進行工藝篩選。通過均值計算和極差分析得知，各因素對姜黃揮發油提取效果影響大小的順序為提取時間>粉碎粒度>料液比>浸泡時間。通過驗證實驗發現浸泡時間對實驗結果幾乎沒有影響，為了提高效率，藥材均不浸泡。在通過比較實驗后，確定了最佳工藝組合為A1B2C1D3/A3B2C1D3，即提取時間6.0 h，料液比1∶20(g/mL)，粉碎粒度80目。采用乙醇溶液回流法，應用L9(34)正交實驗設計，優化姜黃素的提取工藝。根據預實驗結果，設置了4個影響因素，即乙醇溶液濃度、提取時間、提取次數和粉碎粒度，并分別設置了3個水平進行工藝篩選。通過均值計算和極差分析得知，各因素對姜黃素提取效果影響大小的順序為乙醇濃度>粉碎粒度>提取時間>提取次數。實驗中發現每次提取1.5 h與提取2.0 h的結果差異不明顯，為了節省時間，提高效率，將每次提取時間確定為1.5 h。由此確定采用的工藝組合為A2B2C2D3，即乙醇濃度75%，提取時間1.5 h/次，提取次數3次，粉碎粒度80目。此實驗方法有效地提高了海南產姜黃有效成分的提取效率。