酵母菌降解亞硝酸鹽條件優(yōu)化

趙慧娟,于濤,許梓文

(1.長春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，長春 130031；2.吉林大學(xué)，長春 130012)

亞硝酸鹽是氮循環(huán)中重要的產(chǎn)物，廣泛存在于自然界中，例如水體、土壤、蔬菜、水果中都含有一定的亞硝酸鹽，具有防腐抗菌作用[1，2]。食品中的亞硝酸鹽除天然來源外，硝酸鹽在微生物作用下轉(zhuǎn)化在食品中添加也是其主要來源。亞硝酸鹽是一種對人體有害的強毒性物質(zhì)，在適當條件下可與食物或胃中共存的仲胺類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)生成致癌物亞硝胺，可誘發(fā)人體多種癌癥[3]。因此，利用化學(xué)、生物技術(shù)的方法來降低食品和水中亞硝酸鹽含量一直是研究的熱點。

酵母菌是一群單細胞的真核微生物，由于酵母菌的細胞內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)和維生素，所以經(jīng)常做成高級營養(yǎng)品添加到食品中。據(jù)研究，酵母菌能夠在亞硝酸鹽的降解中起到相應(yīng)作用[4]，但目前此方面的報道較在不同的試驗條件下對亞硝酸鹽的降解影響，為食品加工中亞硝酸鹽的降低提供依據(jù)[5-8]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高活性干酵母：由湖北安琪酵母公司提供；生牛肉、生豬肉、豬肉香腸、魚肉香腸、臘腸和自制香腸：均購自長春中東大市場；HCl、飽和硼砂溶液、亞鐵氰化鉀溶液、乙酸鋅溶液、對氨基苯磺酸溶液、鹽酸萘乙二胺溶液、酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、亞硝酸鈉：均購自長春天美生物公司；其他試劑：均為國產(chǎn)分析純。

TU-1901型雙光束紫外分光光度計 北京普析公司；SW-CJ-LF型超凈工作臺、HHS-21-6型水浴鍋、BSD-YX3200型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海博訊公司；YXQ-SG41-280型高壓滅菌鍋 上海林馨公司；pHSJ-5型實驗室pH計 上海大中公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 亞硝酸鹽含量的測定

采用鹽酸萘乙二胺法，主要參照GB/T 5009.33-2003《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備配制

YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 L；配制含亞硝酸鹽的YPD培養(yǎng)基：1 L的YPD液體培養(yǎng)基中加入200 mg的亞硝酸鈉。

1.2.3 單因素試驗

考察不同接種量對酵母菌降解亞硝酸鹽的影響：配制酵母菌液體培養(yǎng)基1 L，在其中加入亞硝酸鈉使?jié)舛葹?00 mg/L，加入0.5%的NaCl，充分混勻后，分成5份，每份200 mL。經(jīng)121 ℃滅菌15 min后，調(diào)pH為5，分別接入1%，2%，3%，4%，5%的經(jīng)活化2 h后的酵母菌，于30 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3天；不同培養(yǎng)時間下酵母菌降解亞硝酸鹽的差異比較：配制酵母菌液體培養(yǎng)基1 L，加入亞硝酸鈉使?jié)舛葹?00 mg/L，加入0.5%的NaCl，充分混勻后，分成5份，每份200 mL。經(jīng)121 ℃滅菌15 min后，調(diào)pH為5，接入3%的經(jīng)活化2 h后的酵母菌，分別于30 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)1，2，3，4，5天；酵母菌在不同pH下降解亞硝酸鹽的差異比較：配制酵母菌液體培養(yǎng)基1 L，在其中加入亞硝酸鈉使?jié)舛葹?00 mg/L，加入0.5%的NaCl，充分混勻后，分成5份，每份200 mL。經(jīng)121 ℃滅菌15 min后，分別調(diào)pH至3，4，5，6，7。以3%的接種量接入活化2 h的酵母菌,于30 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3天；不同NaCl含量對酵母菌降解亞硝酸鹽的影響比較：配制酵母菌液體培養(yǎng)基1 L，在其中加入亞硝酸鈉使?jié)舛葹?00 mg/L，充分混勻后，分成5份，每份200 mL，分別加入0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%的NaCl。經(jīng)121 ℃滅菌15 min后，調(diào)pH為5。以3%的接種量接入活化2 h的酵母菌,于30 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3天。進行單因素試驗，考察各因素變量對亞硝酸鹽含量的影響。

1.2.4 酵母菌降解亞硝酸鹽條件正交試驗

在單因素試驗中，每因素篩選出3個水平建立L9(34)正交試驗，以亞硝酸鹽含量為指標進行正交試驗，見表1。

表1 酵母菌降解亞硝酸鹽L9(34)因素水平表Table 1 L9(34) factors and levels table of degradation factors of nitrite by yeast

1.2.5 比較酵母菌對6種肉制品在不同時間段亞硝酸鹽降解的效果

選擇生牛肉、生豬肉、豬肉香腸、魚肉香腸、臘腸和自制香腸6種市售肉制品進行優(yōu)化條件下的培養(yǎng)，比較不同培養(yǎng)時間亞硝酸鹽的殘留情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸鹽標準曲線

采用鹽酸萘乙二胺法[9]，試樣經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)，除去脂肪后，在弱酸條件下亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，對可見光有選擇性吸收，在538 nm處，吸光度與溶液中的亞硝酸鹽含量成正比，外標法測得亞硝酸鹽含量，見圖1。

圖1 亞硝酸鹽標準曲線Fig.1 Standard curve of nitrite

2.2 單因素試驗

2.2.1 不同接種量對酵母菌降解亞硝酸鹽的影響

圖2 接種量對亞硝酸鹽含量的影響Fig.2 Effect of innoculation quantity on nitrite content

由圖2可知，在pH值、NaCl含量和培養(yǎng)時間不變的情況下，隨著接種量的提高，酵母菌對亞硝酸鹽的降解效果受到顯著影響，當接種量為4%時，OD值達最低，此時亞硝酸鹽降解率最高。當接種量大于4%時，OD值升高，這是由于接種量的大小決定了菌種生長繁殖的速度。采用較大的接種量可以縮短菌絲繁殖達到高峰的時間，減少雜菌的生長機會，但接種量過大也會產(chǎn)生競爭抑制，反而使亞硝酸鹽降解能力下降，故選取2%，3%，4%的接種量。

2.2.2 不同培養(yǎng)時間對酵母菌降解亞硝酸鹽的影響

圖3 培養(yǎng)時間對亞硝酸鹽含量的影響Fig.3 Effect of cultivation time on nitrite content

由圖3可知，在pH值、NaCl含量和接種量不變的情況下，改變酵母菌的培養(yǎng)時間，OD值呈現(xiàn)先低后高的趨勢，隨著培養(yǎng)時間的延長，OD值逐漸升高，降解率下降。這說明時間是在乳酸菌降解亞硝酸鹽過程中起影響作用的一個因素，故選取1，2，3天。

2.2.3 不同pH值對酵母菌降解亞硝酸鹽的影響

圖4 pH值對亞硝酸鹽含量的影響Fig.4 Effect of pH values on nitrite content

由圖4可知，隨著酵母菌生長環(huán)境的pH升高，OD值和降解率發(fā)生明顯變化，當pH為4時降解效果最佳。這是由于亞硝酸鹽在酸性條件下不穩(wěn)定，可以發(fā)生一定程度的自然降解，在酵母菌的作用下，降解作用發(fā)生變化。在此基礎(chǔ)上選取pH為3，4，5進入正交試驗。

2.2.4 NaCl含量對酵母菌降解亞硝酸鹽的影響

圖5 NaCl含量對亞硝酸鹽含量的影響Fig.5 Effect of NaCl content on nitrite content

由圖5可知，隨著NaCl含量的增加，OD值呈降低趨勢，降解率逐漸增加。這可能是由于Na+的存在與亞硝酸鹽還原酶的作用有一定關(guān)系，亞硝酸還原酶是一類能還原亞硝酸鹽的酶，可以利用酶催化反應(yīng)將亞硝酸鹽降解。同時，NaCl濃度越高，對硝酸還原菌的抑制作用越大，亞硝酸鹽的生成速度越慢，從而影響亞硝酸鹽的降解，但NaCl含量過高，也會抑制酵母菌對亞硝酸鹽的降解作用，故選取NaCl含量為0.5%，0.7%，0.9%。

2.3 酵母菌降解亞硝酸鹽條件優(yōu)化結(jié)果與分析

根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，采用L9(34)正交試驗設(shè)計方法對整體工藝進行優(yōu)化，正交試驗結(jié)果與極差分析見表2。

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果與極差分析Table 2 The orthogonal experimental results and range analysis

由表2可知，各項影響因素最佳水平組合為A2B3C1D2，即pH為4，接種量為4%，培養(yǎng)時間為1天，NaCl含量為0.7%。通過K值比較，最佳組合為A2B1C1D2，兩者不相符，故按照K值組合進行驗證試驗。經(jīng)試驗，OD值為0.0113，此時酵母菌的降解率為98.07%。

根據(jù)試驗結(jié)果分析，各試驗影響因素在所選水平范圍內(nèi)對酵母菌降解亞硝酸鹽的影響能力排序為：D>B>C>A，即NaCl含量是最大的影響因素。這是由于NaCl可能增強亞硝酸鹽的活性，及在一定濃度下對酵母有保護作用。而酵母接種量的多少決定了菌種生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短菌絲繁殖達到高峰的時間，可減少雜菌的生長機會。當然，接種量過大對于后期亞硝酸鹽的降解也有不利影響。當培養(yǎng)時間不同時，亞硝酸鹽降解的效果也不相同，菌種生長期的不同導(dǎo)致了菌體生長量的差異，從而在亞硝酸鹽的降解效果上影響較大。根據(jù)陳中等[10]的研究，乳酸可以通過與亞硝酸鹽發(fā)生歧化反應(yīng)達到去除亞硝酸鹽的目的，故pH值的調(diào)節(jié)也可間接對亞硝酸鹽的降解產(chǎn)生影響。

2.4 酵母菌對6種肉制品中亞硝酸鹽降解效果比較

圖6 酵母菌對6種肉制品中亞硝酸鹽降解效果比較Fig.6 Comparison of the effects of yeast on the degradation of nitrite in six meat products

由圖6可知，在不同的培養(yǎng)時間，肉制品中亞硝酸鹽含量隨時間的變化不同，受多種因素的影響。當pH為4，接種量為4%，NaCl含量為0.7%時對各種肉制品降解情況進行試驗。由圖6可知，12 h時酵母菌對肉制品中亞硝酸鹽的降解影響很小，在12～24 h時，亞硝酸鹽殘留量迅速下降，降解曲線出現(xiàn)大幅下降。在48 h時，酵母菌對豬肉香腸和魚肉香腸中亞硝酸鹽的降解效果最好，生豬肉在60 h降解達到頂峰，72 h時市售臘腸和自制香腸的降解最佳。除去試驗其他因素的干擾，這是由于菌種在不同生長環(huán)境下生長期的不同導(dǎo)致了菌體生長量的差異，從而在亞硝酸鹽的降解效果上影響較大，但在24 h之后均能先后達到降解最佳效果。

3 結(jié)論

本研究初步研究了酵母菌對亞硝酸鹽降解的效果，通過單因素試驗和正交試驗的方式，考察了pH、接種量、培養(yǎng)時間和NaCl 4個因素對亞硝酸鹽降解的影響。結(jié)果表明：各試驗影響因素在所選水平范圍內(nèi)對酵母菌降解亞硝酸鹽的影響能力排序為：D>B>C>A，即NaCl>接種量>培養(yǎng)時間>pH，NaCl含量是最大的影響因素。酵母菌降解亞硝酸鹽的最佳條件為NaCl含量0.7%，接種量2%，培養(yǎng)時間1天，pH 4。通過對6種不同肉制品的實驗證明，酵母菌能夠有效降解食品和環(huán)境中的亞硝酸鹽，這對于保護人類健康具有重要意義。