醬油選育菌種制曲條件的優化研究

萬萍，周琳，孫杰，吳枚枚，段獻銀，劉達玉

(成都大學 藥學與生物工程學院，成都 610106)

醬油作為中國傳統發酵食品，歷史悠久，兼具色、香、味，并且營養豐富，是中國百姓生活中不可缺少的調味品之一。經過幾千年的改進與創新，我國醬油生產已經有了很大的發展，整個釀造工藝也不斷趨于完善。然而，目前我國醬油釀造業與日本相比仍具有較大差距。我國醬油生產仍然面臨產品質量不高、成曲質量不良、原料轉化率低、發酵周期長等問題。這些問題的存在，嚴重制約了我國醬油行業的發展和國際競爭力的提升。優良菌種及其優質成曲是提高醬油質量的關鍵。影響制曲的因素主要有生產菌種、原料選擇、水源質量、浸泡時間、蒸煮時間、焙炒條件、溫度情況、濕度情況、通風情況、翻曲情況、制曲時間等[1-4]。本文采用選育性能良好的醬油專用菌種，首先分析制曲過程中影響成曲品質的因素，在分析各制曲影響因素的基礎上，設計正交試驗進一步優化醬油制曲工藝及其主要參數，以期提高種曲質量，尤其是提高蛋白酶、糖化酶的活力，進而提高蛋白原料的利用率。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

四川大豆、標準面粉、麩皮:由自貢天味食品有限公司與富順美樂食品有限公司提供；米曲霉A3-U12:通過改良雙層酪蛋白培養基進行選擇，分離出優良的生產菌株，再進行紫外誘變篩選獲得[5]；酪蛋白：購于廣州喬宣化工有限公司；酪氨酸：購于浙江綠州生物技術有限公司；福林酚試劑：購于廣州翔博生物技術有限公司。

1.2 主要儀器設備

ZHJH-2112B生物潔凈工作臺、V63旋渦振蕩器、LRH-250生化培養箱、721型分光光度計等。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基的制備

1.3.1.1 種曲培養基

種曲培養基的配制：麩皮∶豆粉∶面粉為80∶15∶5，自來水100 mL，pH自然，潤水20 min，于121 ℃濕熱滅菌30 min。

1.3.1.2 成曲培養基

大豆∶面粉為90∶10，pH自然。大豆的處理方法：大豆挑選后，在40 ℃溫水中浸泡3 h，瀝干，然后于121 ℃濕熱滅菌30 min；面粉的處理方法：將面粉焙炒至金黃色，不能焦糊；制備成曲培養基：將大豆在不銹鋼盆里攤冷，待熱氣接近消失時，均勻拌入焙炒好的面粉即可[6]。

1.3.2 制曲工藝流程

制曲工藝流程見圖1。

圖1 制曲工藝流程Fig.1 Process flow of soy sauce koji making

1.4 理化指標的測定方法

蛋白酶活力的測定：福林法[7]；糖化酶活力的測定：斐林法[8]。

2 結果與分析

2.1 制曲優化試驗

2.1.1 試驗設計與結果

本試驗采用L9(34)設計，不考慮因素間的交互作用，留一項空白列作為誤差項，分別在3 h，30 min和36 h兩邊選取其他水平，每個水平做3個重復，主要以蛋白酶活力作為評價標準，輔以糖化酶活力來進行綜合評判，分析不同因素對制曲的影響程度，確定制曲的優勢工藝組合。

表1 試驗方案及其結果Table 1 Scheme and results of experiment

2.1.2 正交試驗的直觀分析

表2 蛋白酶活力的直觀分析表Table 2 Visual analysis of protease activity

表3 糖化酶活力的直觀分析表Table 3 Visual analysis of glucoamylase activity

由直觀分析表2和表3中的極差大小順序可知，影響成曲中蛋白酶活力的因素主次為A>B>C，最佳方案為A2B2C3，即浸豆時間3 h,蒸料時間30 min，制曲時間40 h；影響成曲中糖化酶活力的因素主次為B>A>C，最佳方案為A2B2C2，即浸豆時間3 h,蒸料時間30 min，制曲時間36 h。這2種酶活力的最佳方案不同的原因是由于蛋白酶和糖化酶在當前環境條件下的生成速率和穩定性不同。

圖2 酶活力直觀趨勢圖Fig.2 Trend chart of protease activity and glucoamylase activity

由圖2可知，蛋白酶活力和糖化酶活力在浸豆時間3 h和蒸煮時間30 min時產酶活力較高，其中浸豆時間的趨勢圖拐點說明浸豆3 h對產酶最有利，蒸煮時間在20～30 min內對酶活的影響趨勢比較平緩，說明此時間段內的大豆蛋白變性速度減緩，30 min后明顯呈下降趨勢，說明30 min后大豆蛋白很快就過度變性了；而隨制曲時間的延長，酶活力變化趨勢相對較平穩。2種酶的趨勢圖有所不同，特別是制曲時間的趨勢圖，可以初步判斷2種酶達到最大酶活力的時間不同。由蛋白酶活力和糖化酶活力的分析結果可知，其各自對酶活力的影響程度與直觀分析中極差大小順序是一致的，為了制得高蛋白酶活力和酶系豐富的成曲，在不考慮交互作用的情況下，綜合上述結果，確定最優方案為A2B2C3，即浸豆時間3 h，蒸煮時間30 min，制曲時間40 h。但由于制曲時間對2種酶活力的影響不顯著，且正交結果分析發現2種酶活力不在同一時間達到峰值，在36～42 h之間的變化趨勢還不明朗，有必要通過驗證試驗來確定最終優方案。

2.2 優化方案驗證試驗

依據正交試驗結果，選取制曲時間36，37，38，39，40，41，42 h，在浸豆時間3 h和蒸煮時間30 min的條件下制曲，測定蛋白酶和糖化酶活力在此時間段內的酶活力變化情況，確定最終優方案。

圖3 酶活力隨制曲時間的變化趨勢Fig.3 Trend of enzymatic activity with changes of koji-making time

由圖3可知，糖化酶活力在38 h時達到峰值936.73 U/g干曲，與正交試驗確定的最優方案推遲了2 h，從其直觀分析表中可以看到，制曲時間中的k2和k3相差很小，在36～40 h內可能出現其最大酶活力峰值；而蛋白酶活力在40 h時達到峰值1435.52 U/g干曲，與正交試驗的結果吻合。由糖化酶活力的變化趨勢可以看到，糖化酶活力在此時間段內還是比較穩定的，而且蛋白酶和糖化酶活力都高于其他試驗值，因此在“以蛋白酶為主，兼顧糖化酶”的原則下，可以確定制曲條件的最優方案為A2B2C3，即浸豆時間3 h，蒸煮時間30 min，制曲時間40 h。

3 結論

醬油制曲影響蛋白酶活力的因素主次順序為浸豆時間>蒸煮時間>制曲時間，其中浸豆時間和蒸煮時間對蛋白酶活力有顯著影響，較優水平為浸豆時間3 h、蒸煮時間30 min、制曲時間40 h；同時也得出了糖化酶活力的因素主次順序為蒸煮時間>浸豆時間>制曲時間，其中蒸煮時間和浸豆時間對糖化酶活力有顯著影響，較優水平為浸豆時間3 h、蒸煮時間30 min、制曲時間36 h。在正交試驗的基礎上，較優方案的驗證試驗結果表明,在浸豆時間3 h和蒸煮時間30 min的條件下，蛋白酶活力在40 h時達到了最大值1435.52 U/g干曲，糖化酶活力在38 h時達到了最大值936.73 U/g干曲。因此，在“以蛋白酶為主，兼顧糖化酶”的原則下，最終確定制曲的最佳工藝條件為浸豆時間3 h，蒸煮時間30 min，制曲時間40 h。