自然發酵甜面醬中芽孢桿菌的分離、篩選及鑒定

劉達玉，劉陽，鄧靜，楊進軍，姜元華*

(1.成都大學 生物工程學院，成都 610106；2.四川旅游學院，成都 610100)

甜面醬是以小麥粉或面粉為主要原料，經制曲和保溫發酵制成的一種醬狀調味品[1]，其味甜中帶咸，同時擁有醬香和酯香。甜面醬含有多種風味物質和豐富的營養物，在人們日常生活中是不可或缺的調味品，其在烹飪醬爆和醬燒菜中，具有上色、提鮮、增香的作用；此外，甜面醬還作為黃瓜、大蔥、烤鴨等菜品的蘸料，其味道鮮甜可口，具有增加食欲的功效，深受廣大消費者喜愛[2-4]。

甜面醬屬于傳統發酵醬類制品，其在形成過程中與微生物活動密不可分。目前，甜面醬研究中已研究報道的有霉菌、酵母菌、細菌等，其中霉菌主要包括米曲霉、黑曲霉、根霉等，酵母菌主要為假絲酵母、產酯酵母等，細菌則為芽孢桿菌、乳酸菌等[5-7]。霉菌主要是在甜面醬發酵的前期發揮作用，諸如米曲霉、毛霉、根霉和黑曲霉等是制曲階段的主要菌種，其中米曲霉與釀造過程的快慢、顏色、滋味有直接關系[8,9]；酵母菌主要是在甜面醬發酵的第二個階段起作用，在無氧環境下酵母菌通過EMP途徑將葡萄糖分解最終還原生成乙醇，對甜面醬的特有香氣有一定的促進作用[10]；細菌在甜面醬發酵過程中也至關重要，醬醅中的乳酸菌可發酵糖類，進行乳糖代謝，對醬制品風味有著重要的貢獻[11]；此外，一些芽孢桿菌在發酵過程中可利用淀粉酶、蛋白酶降解的小分子糖類和氨基酸等進行生長，并通過發酵產酸和氨基酸等物質，形成了醬類成品的風味成分和營養成分[12]。

可見，在甜面醬發酵形成過程中，各種微生物共同協作，才使得其營養豐富、風味香醇。現階段在甜面醬的研究中，人們對霉菌和酵母菌進行了很多研究，對細菌的研究相對較少，特別是忽略了芽孢桿菌的重要性。芽孢桿菌是一類優秀的潛在益生菌，擁有繁殖速度快，產酶性能高，抵抗有害病原菌效果好等優點，工業生產中常用作動物微生態制劑的生產菌種[13-15]。目前，芽孢桿菌在甜面醬發酵中發揮的作用有待深度探討，其對甜面醬形成的風味成分和營養物質有何種關系還是未知，因此非常有必要對甜面醬中的芽孢桿菌進行分離、篩選，并對其相關特性進一步研究。本實驗從成熟的自然發酵甜面醬中，分離、篩選得到芽孢桿菌，并對其進行形態學觀察和分子生物學鑒定，從而確定其種屬，為進一步探究其在甜面醬發酵過程中的作用機理提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料來源

樣品：成熟的自然發酵甜面醬，四川自貢仙味源釀造有限公司提供。

1.1.2 儀器與設備

SHP0201147047型電子分析天平 上海恒平科學儀器有限公司；SW-CJ-IF型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；SM530C型立式壓力蒸汽滅菌器 成都盛德先華科貿有限公司；BH200型微生物顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司；LRH-250型生化培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；QYC-2102C型搖床 上海福瑪實驗設備有限公司；TGL-16B型臺式高速離心機 湖南星科科學儀器有限公司；S-3C型pH計 成都世紀方舟科技有限公司；S1000型PCR擴增儀、Gel Doc 2000型凝膠成像系統 美國BIO-RAD公司；DY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.1.3 主要試劑

蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂、葡萄糖、肌酸、甲基紅試劑、溴甲基酚紫、麥芽糖、乳糖、蔗糖、氫氧化鈉、酵母浸膏、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸鈉、硫代硫酸鈉、草酸銨、結晶紫、碘化鉀、碘、鹽酸、甘油、甲醛、苯酚、品紅、異戊醇、乙醇、溴化乙錠(EB)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)：購于成都市科龍化工試劑廠。

1.1.4 培養基

牛肉膏蛋白胨固體培養基：蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉膏3 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min(液體培養基不加瓊脂即可)。

PCA培養基：胰蛋白胨5 g，酵母浸膏2.5 g，葡萄糖1 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.8～7.2，121 ℃滅菌20 min。

蛋白胨水培養基：蛋白胨 10 g，氯化鈉 2.5 g，水1000 mL，pH 7.4～7.6。

葡萄糖蛋白胨培養基：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，磷酸氫二鉀5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2。

H2S培養基：葡萄糖20 g，氯化鈉5 g，檸檬酸鈉0.5 g，硫代硫酸鈉0.5 g，瓊脂5～8 g，水1000 mL，pH 7.2。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株分離

三角瓶中加入99.0 mL牛肉膏蛋白胨液體培養基，再加入1.0 g自然發酵的甜面醬，置于37 ℃，140 r/min搖床富集培養24 h。將培養好的菌懸液于85 ℃水浴15 min，用移液槍取1.0 mL菌懸液，以無菌水按10倍系列梯度稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。分別吸取不同梯度的菌懸液各0.1 mL，無菌環境下在牛肉膏蛋白胨平板上涂布分離，于37 ℃生化培養箱中培養48 h后，挑選單菌落純化培養。

1.2.2 芽孢桿菌的篩選

選取單菌落進行芽孢染色，挑出產生芽孢的菌落，進一步在牛肉膏蛋白胨平板純化培養，并多次于固體培養基中四區劃線分離，37 ℃培養24 h后，仔細觀察菌落形態并進行記錄。確認為純培養物后，取菌落的一部分轉接到牛肉膏蛋白胨斜面培養基中同條件培養24 h，待生長旺盛后，置于4 ℃冰箱中保藏，每月移種1次，另取生長旺盛的菌體用甘油懸液保藏法保藏，以備用于后續實驗。

1.2.3 形態學鑒定

1.2.3.1 菌落形態觀察

按無菌操作將各個菌株接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基，37 ℃培養48 h，觀察菌落大小、形態、顏色、光澤度、透明度等，做好記錄。

1.2.3.2 個體形態觀察

芽孢染色：取潔凈的小試管加入0.2 mL無菌水，加入1～2接種環的芽孢桿菌的菌苔充分混合得到菌懸液；在菌懸液中加入0.2 mL苯酚品紅溶液，沸水浴加熱3～5 min；接種環挑取少量菌懸液，在載玻片上涂薄，風干，用95%乙醇沖洗載玻片至無紅色液流出；再用自來水沖洗，濾紙吸干；吸取少量黑色素溶液于涂片處，均勻涂薄，自然干燥，進行油鏡觀察。

按革蘭氏染色法對各菌株染色，辨別其為陽性菌或是陰性菌；并在100倍油鏡下觀察其菌體形態、大小、有無芽孢及著生位置等，嚴謹觀察、描述、拍照、記錄。

1.2.4 生理生化實驗鑒定

對芽孢桿菌進行了酶觸反應、糖發酵實驗、甲基紅實驗、VP實驗、H2S實驗、吲哚實驗、明膠液化、檸檬酸鹽的利用實驗，對已經分離出的芽孢桿菌進行鑒定，從而確定其生理生化特性。

1.2.5 16S rDNA菌種鑒定

分子鑒定的主要依據是細菌的16S rDNA片段，其具有高度的保守性、穩定性，可作為分子指標，快速、準確、簡便地對微生物進行分類鑒定。本研究中DNA的提取參考吉志偉等[16]的方法；PCR擴增采用引物27F/1492r對醋酸菌和乳酸菌的16S rDNA區進行特異性擴增，其PCR擴增體系參考文獻[17]，將結果送至上海杰李生物技術有限公司測序，將所測定菌株的16S rDNA序列同GenBank中已提交的序列進行B1ast N分析和同源比對，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種，進一步確定菌株的種屬性質。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌的篩選

通過1.2.2的實驗步驟，用標準枯草芽孢桿菌作對照菌，獲得純種芽孢桿菌共計13株，分別標明為B1，B2，B3，B4，B5，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13。進行芽孢染色之后，將各菌株置于微生物顯微鏡下油鏡觀察，在淡紫灰色背景的襯托下，菌體呈現白色，菌體內的芽孢呈現紅色。部分染色照片見圖1(a～c)，由此可初步判斷該13株菌株均為芽孢桿菌(圖片均能清晰觀察，考慮到全部顯示凸顯多余，則以少許圖片為代表表明結果)。

圖1 芽孢染色(10×100)Fig.1 Spore staining (10×100)

2.2 形態學鑒定

對分離出的13株細菌的菌落形態進行觀察鑒定，其形態表征結果見表1。通過各菌株革蘭氏染色結果可知，13株菌株均為陽性菌。菌落形態、個體形態圖片詳見圖2和圖3。由于本實驗菌株圖片太多，選取3種菌株作為代表。

表1 芽孢桿菌形態描述Table 1 The description of morphology of Bacillus

續 表

圖2 芽孢桿菌菌落形態Fig.2 The colony morphology of Bacillus

圖3 芽孢桿菌菌體形態(10×100)Fig.3 The cell morphology of Bacillus(10×100)

2.3 生理生化鑒定結果

按照1.2.4的生理生化實驗方法步驟，對已篩選得到的13株芽孢桿菌進行鑒定，各個實驗鑒定菌株結果見表2。通過不同芽孢桿菌對每個實驗結果的不同，確定生理特性，從而得出菌株的種類。

表2 生理生化試驗結果Table 2 The results of physiological and biochemical test

續 表

注：“+”表示實驗結果為陽性，“-”表示實驗結果為陰性。

2.4 16S rDNA菌種鑒定

根據1.2.5的方法步驟，篩選到13株芽孢桿菌，并得到各個菌株的16S rDNA序列，具體各菌株測序結果見表3。由于本實驗菌株較多，故選取3種菌株作為代表。將各個菌株的16S rDNA序列在CNBI基因庫中進行同源性比較，獲得和各菌株序列相似度最高的菌株，即初步認定該菌株種類，具體結果見表4。

表3 16S rDNA基因序列Table 3 The genetic sequence of 16S rDNA

續 表

表4 16S rDNA菌種鑒定Table 4 The identification of 16S rDNA strain

3 結論

本實驗利用10倍梯度稀釋法涂布平板，從自然發酵的甜面醬中篩選芽孢桿菌，共計得到13株菌株，其革蘭氏結果均為陽性。各菌株的單菌落形態呈圓形，白色，直徑1～5 mm，不透明，邊緣整齊，菌體的顯微形態多為橢圓或柱狀，芽孢基本分布在細胞體的中心。通過對其進行菌落、顯微形態觀察和16S rDNA片段擴增及序列分析技術分析，最終確定13株菌株中：菌株B2，B4，B5，B6，B7，B8，B11，B12為枯草芽孢桿菌，菌株B3，B10，B13為解淀粉芽孢桿菌，菌株B1為特基拉芽孢桿菌，菌株B9為短小芽孢桿菌。

現階段，芽孢桿菌在甜面醬發酵中發揮的作用有待深度探討，其對甜面醬形成的風味成分和營養物質有何種關系還是未知，因此本研究所得菌株可為進一步探究其在甜面醬發酵過程中的作用機理奠定重要基礎。