牛大腸桿菌病滅活疫苗的制備及小鼠攻毒試驗分析

赫鳴睿

摘要：近年來關于規模化牛場犢牛腹瀉的報道日漸增多，大腸桿菌是引起犢牛腹瀉最常見的病原體。本研究對發病牛分離得到的大腸桿菌菌株進行生化試驗、PCR鑒定、動物致病性試驗、細菌滅活、疫苗制備、小鼠免疫和攻毒保護試驗。PCR結果表明大腸桿菌JS160810含有毒力基因F41、Sta、K99，大腸桿菌ZD150808含有毒力基因irp2、FyuA、Stxl，動物致病性試驗結果表明都具有很強致病性。小鼠的最佳免疫劑量為1.5×10¹⁰CFU。攻毒保護結果氫氧化鋁膠佐劑疫苗的保護率為80%，說明疫苗能產生良好的免疫應答。為今后進行田間試驗提供了理論依據，并將為防治牛大腸桿菌病提供一種保護范圍更加全面的生物制品。

關鍵詞：多價疫苗;犢牛;腹瀉;強致病性;大腸桿菌病

中圖分類號：S855.1⁺2 文獻標識碼：A 文章編號：2095-9737（2018）10-0023-03

犢牛腹瀉常由于腸道內的細菌、病毒等病原微生物或者營養、環境等因素所致。其中致病性大腸桿菌是犢牛腹瀉發病的最主要因素之一[1-2]。導致犢牛腹瀉的大腸桿菌毒力因子主要有腸毒素和菌毛黏附素等。犢牛大腸桿菌病有著較高的發病率及死亡率，而且還會繼發感染其他疾病。因為大腸桿菌擁有血清型眾多、細菌變異性大、抗原復雜等特點，并且不同地區流行的血清型菌株之間又存在著很大的差別[3]。抗生素在大腸桿菌病預防及治療方面有著積極作用，但是隨著抗生素的使用不當，大腸桿菌耐藥譜和耐藥水平不斷提高，大腸桿菌多重耐藥現象已十分嚴重。如今新型抗生素不斷問世，但抗生素的研制速度遠遠低于耐藥菌的發展速度。外界環境對細菌作出刺激后，細菌會大量產生毒力因子，這些因子的功能各不相同，在細菌致病的過程中起到重要作用。目前，國內外先后出現了很多種相應預防犢牛腹瀉的試驗性疫苗，其中包含以抗黏附素免疫為基礎的含單價或多價黏附素抗原的滅活全菌苗、基因工程亞單位疫苗等。然而因為大腸桿菌的血清型比較多，各地分離菌株攜帶的毒力因子及生物學特性又有所不同，使得疫苗的應用受到很大限制，至今還沒有普遍應用的預防犢牛大腸桿菌腹瀉的商品化菌苗[4]。因此，按照不同地區致病性大腸桿菌的優勢血清型研制出真正有效的滅活疫苗具有現實的生產意義[5]。

1 材料

大腸桿菌JS160810、ZD150808分別從齊齊哈爾市和肇東市某奶牛場發病犢牛分離并保存。試驗動物為18～22g昆明系小鼠購自北京維通利華動物有限公司。蜂膠佐劑和氫氧化鋁膠佐劑由本實驗室保存;革蘭氏染色液購自安徽省巢湖市弘慈醫療器械有限公司;改良Minca肉湯、營養瓊脂、伊紅美藍凱瓊脂等均購自青島高科園海博生物技術有限公司;生化試驗管購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

2 方法

2.1 菌液制備及鏡檢

將菌種材料分別在無菌環境下用細菌接種環接種于伊紅美藍培養基上再放置于37℃恒溫箱內培養24h后觀察結果。挑取伊紅美藍培養基上生長的單個菌落將細菌涂在載玻片上干燥后進行革蘭氏染色，并用顯微鏡進行鏡檢觀察。分別挑取伊紅美藍培養基上各菌種的單個菌落接種于改良Minca肉湯中放入37℃空氣浴搖床中進行細菌增殖培養16h做疫苗菌液。

2.2 細菌生化鑒定

無菌環境下使用接種環挑取各菌種單個菌落純培養物分別接種到蔗糖、麥芽糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、甘露醇、糊精、肌醇、葡萄糖、半乳糖、乳糖、山梨醇、果糖、明膠、葡萄糖磷酸鹽溶液、蛋白胨水等生化管中37℃培養24h后，觀察結果并記錄。

2.3 大腸桿菌毒力因子PCR鑒定

煮沸法提取細菌DNA：取100μL菌液于潔凈的EP管中，再在管中加入100μL磷酸鹽緩沖溶液（PBS）進行混合，將EP管至于高速離心機12000r/min離心3min，棄掉上清，按上述步驟用PBS對菌液進行洗滌2～3次，洗滌后將EP管至于100℃沸水中水浴20min，12000r/min離心15min，吸上清于4℃冰箱保存，作為模板DNA。

PCR反應體系：上游引物（10μM）0.5μL，下游引物（10μM）0.5μL、模板DNA1μL、TaqMasterMix（5u/μL）12.5μL，補水至總體積為25μL。反應程序：94℃預變性5min;94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30個循環;72℃終延伸5min。反應結束后，PCR產物加入1%瓊凝膠用紫外凝膠成像系統觀察并拍照保存。

2.4 大腸桿菌半數致死量（LD₅₀）的測定

將JS160810、ZD150808各菌株菌液分別稀釋至1.0×10⁹CFU/mL、1.0×10⁸CFU/mL、1.0×10⁷CFU/mL、1.0×10⁶CFU/mL、1.0×10⁵CFU/mL、1.0×10⁴CFU/mL、1.0×10³CFU/mL、1.0×10²CFU/mL、1.0×10¹CFU/mL的菌數分別腹腔注射小鼠，同時設生理鹽水的對照組，共注射190只小鼠，隨機分成19組，每組10只小鼠，每只0.2mL，同時設生理鹽水的對照組，在注射后第1-7天不同時間段對小鼠進行觀察。

2.5 疫苗制備

將菌株JS160810和菌株ZD150808菌液利用甲醛溶液進行滅活，甲醛溶液的終濃度為0.15%，將含有甲醛的菌液放置37℃空氣浴搖床中培養24h進行滅活，將滅活后的菌液分別接種在普通營養瓊脂培養基和改良Minca肉湯中，37℃培養48h檢查菌液滅活效果。將完全滅活的菌液進行濃縮后與氫氧化鋁膠佐劑4：1混合，放入4℃冰箱保存，濃縮后疫苗含菌量為3×10¹⁰CFU/mL。

2.6 疫苗的安全性檢驗

將制備好的疫苗接種于伊紅美藍瓊脂平板和改良Min-ca肉湯培養基中，37℃培養2天，觀察有無細菌生長。取10只小自鼠，分別皮下注射疫苗，0.5mL/只;觀察10天，記錄食欲及精神狀態。

本實驗共分成四組進行免疫，分別是Group1（免疫劑量3.0×10⁹CFU/只）;Group2（免疫劑量9.0×10⁹CFU/只）;Group3（免疫劑量1.5×10¹⁰CFU/只）;氫氧化鋁膠佐劑對照組（Control 0.1mL/只），每組20只小白鼠共計80只小白鼠，采用皮下多點注射，共免疫3次，免疫間隔時間為21天。Group1、Group2、Group3、Control每組各取10只小鼠進行重新分組，分成兩個攻毒組每組40只小鼠，用2×LD₅₀活菌液ZD150808和2×LD₅₀活菌液JS160810對兩個攻毒組分別攻毒，攻毒時間為三次免疫結束后第10天，攻毒后觀察7天內小鼠的發病及死亡情況。

3 結果與分析

3.1 疫苗的無菌及安全性檢驗結果

結果均無任何微生物生長。小鼠接種10天后全部健康存活，注射氫氧化鋁膠佐劑疫苗的小鼠注射部位皮膚上有腫塊，無化膿現象。

3.2 細菌鏡檢結果

細菌為兩端鈍圓的革蘭氏陰性短小桿菌，個別菌體可呈近似橢圓形，多單獨或成對存在，不形成芽胞符合大腸桿菌形態特異性

3.3 生化試驗結果

這兩株菌均符合大腸桿菌的生化特性，具體結果見表2。

3.4 PCR檢測結果

JS160810大腸桿菌F41、Sta、K99基因分別在431bp、314bp、163bp處有清晰條帶，與預期目的片段大小相符，見圖1。ZD150808大腸桿菌irp2、fyuA、Stx1基因分別在953bp、531bp、301bp處有清晰條帶，與預期目的片段大小相符，見圖2。

3.5 大腸桿菌半數致死量檢測結果

大腸桿菌JS160810的LD₅₀為1.78×10⁵CFU，大腸桿菌ZD150808的LD₅₀為2.51×10⁵CFU。

3.6 最佳免疫劑量確定及攻毒保護試驗結果

以大腸桿菌JS160810攻毒后Group1在7天內死亡6只小鼠Group2在7天內死亡4只小鼠Group3在7天內死亡2只小鼠，以大腸桿菌ZD150808攻毒后，Group1在7天內死亡7只小鼠，Group2在7天內死亡6只小鼠Group3在7天內死亡2只小鼠，Gro叩3中小鼠存活率都很高，且保護率均為80%。

4 討論

該病一年四季均可發生，犢牛和羔羊多發于冬、春舍飼期間[6-7]。一旦發生，病死率很高，有的甚至能夠達到100%;牛、羊發病時一般呈散發性或地方流行性。大腸桿菌腸毒素的類型分為耐熱型腸毒素（ST）和不耐熱腸毒素（LT）兩類，將它們制成雙聯苗后，可以抵抗各類產腸毒素性大腸桿菌（ETEC）感染[8]。一般來說，動物源性的ETEC菌株只產生ST[9]。據調查，引起犢牛、羔羊腹瀉的ETEC黏附素中 K99和F41相加占50%以上[10]。本試驗利用從黑龍江省部分市區腹瀉犢牛的病料中分離、篩選出的2株致病性大腸桿菌菌株，研制出牛大腸桿菌病滅活苗，病料采集范圍廣泛，涵蓋黑龍江地區各主要規模化養牛場，分離的菌株具有一定的代表性和普遍性，這些都為針對地區流行的牛大腸桿菌病疫苗的研制奠定了良好基礎，經動物實驗證明研制出的地方株大腸桿菌病滅活苗具備較好的保護效果。研究表明，改良Minca肉湯培養的抗原所制備的免疫血清效價高，抗體維持時間長[11]。這是由于液體培養條件下菌株的各種生物學性狀得到充分表達。因此，本試驗采用了液體培養法對疫苗抗原進行培養。要全面有效地控制大腸桿菌病，在采用疫苗免疫的同時還應采取綜合性防治措施，加強飼養管理，提高犢牛抗體水平和減少應激等。

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