牛大腸桿菌病滅活疫苗的制備及小鼠攻毒試驗分析

赫鳴睿

摘要：近年來關(guān)于規(guī)模化牛場犢牛腹瀉的報道日漸增多，大腸桿菌是引起犢牛腹瀉最常見的病原體。本研究對發(fā)病牛分離得到的大腸桿菌菌株進(jìn)行生化試驗、PCR鑒定、動物致病性試驗、細(xì)菌滅活、疫苗制備、小鼠免疫和攻毒保護(hù)試驗。PCR結(jié)果表明大腸桿菌JS160810含有毒力基因F41、Sta、K99，大腸桿菌ZD150808含有毒力基因irp2、FyuA、Stxl，動物致病性試驗結(jié)果表明都具有很強(qiáng)致病性。小鼠的最佳免疫劑量為1.5×10¹⁰CFU。攻毒保護(hù)結(jié)果氫氧化鋁膠佐劑疫苗的保護(hù)率為80%，說明疫苗能產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答。為今后進(jìn)行田間試驗提供了理論依據(jù)，并將為防治牛大腸桿菌病提供一種保護(hù)范圍更加全面的生物制品。

關(guān)鍵詞：多價疫苗;犢牛;腹瀉;強(qiáng)致病性;大腸桿菌病

中圖分類號：S855.1⁺2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-9737（2018）10-0023-03

犢牛腹瀉常由于腸道內(nèi)的細(xì)菌、病毒等病原微生物或者營養(yǎng)、環(huán)境等因素所致。其中致病性大腸桿菌是犢牛腹瀉發(fā)病的最主要因素之一[1-2]。導(dǎo)致犢牛腹瀉的大腸桿菌毒力因子主要有腸毒素和菌毛黏附素等。犢牛大腸桿菌病有著較高的發(fā)病率及死亡率，而且還會繼發(fā)感染其他疾病。因為大腸桿菌擁有血清型眾多、細(xì)菌變異性大、抗原復(fù)雜等特點，并且不同地區(qū)流行的血清型菌株之間又存在著很大的差別[3]。抗生素在大腸桿菌病預(yù)防及治療方面有著積極作用，但是隨著抗生素的使用不當(dāng)，大腸桿菌耐藥譜和耐藥水平不斷提高，大腸桿菌多重耐藥現(xiàn)象已十分嚴(yán)重。如今新型抗生素不斷問世，但抗生素的研制速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于耐藥菌的發(fā)展速度。外界環(huán)境對細(xì)菌作出刺激后，細(xì)菌會大量產(chǎn)生毒力因子，這些因子的功能各不相同，在細(xì)菌致病的過程中起到重要作用。目前，國內(nèi)外先后出現(xiàn)了很多種相應(yīng)預(yù)防犢牛腹瀉的試驗性疫苗，其中包含以抗黏附素免疫為基礎(chǔ)的含單價或多價黏附素抗原的滅活全菌苗、基因工程亞單位疫苗等。然而因為大腸桿菌的血清型比較多，各地分離菌株攜帶的毒力因子及生物學(xué)特性又有所不同，使得疫苗的應(yīng)用受到很大限制，至今還沒有普遍應(yīng)用的預(yù)防犢牛大腸桿菌腹瀉的商品化菌苗[4]。因此，按照不同地區(qū)致病性大腸桿菌的優(yōu)勢血清型研制出真正有效的滅活疫苗具有現(xiàn)實的生產(chǎn)意義[5]。

1 材料

大腸桿菌JS160810、ZD150808分別從齊齊哈爾市和肇東市某奶牛場發(fā)病犢牛分離并保存。試驗動物為18～22g昆明系小鼠購自北京維通利華動物有限公司。蜂膠佐劑和氫氧化鋁膠佐劑由本實驗室保存;革蘭氏染色液購自安徽省巢湖市弘慈醫(yī)療器械有限公司;改良Minca肉湯、營養(yǎng)瓊脂、伊紅美藍(lán)凱瓊脂等均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;生化試驗管購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

2 方法

2.1 菌液制備及鏡檢

將菌種材料分別在無菌環(huán)境下用細(xì)菌接種環(huán)接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上再放置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。挑取伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上生長的單個菌落將細(xì)菌涂在載玻片上干燥后進(jìn)行革蘭氏染色，并用顯微鏡進(jìn)行鏡檢觀察。分別挑取伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上各菌種的單個菌落接種于改良Minca肉湯中放入37℃空氣浴搖床中進(jìn)行細(xì)菌增殖培養(yǎng)16h做疫苗菌液。

2.2 細(xì)菌生化鑒定

無菌環(huán)境下使用接種環(huán)挑取各菌種單個菌落純培養(yǎng)物分別接種到蔗糖、麥芽糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、甘露醇、糊精、肌醇、葡萄糖、半乳糖、乳糖、山梨醇、果糖、明膠、葡萄糖磷酸鹽溶液、蛋白胨水等生化管中37℃培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果并記錄。

2.3 大腸桿菌毒力因子PCR鑒定

煮沸法提取細(xì)菌DNA：取100μL菌液于潔凈的EP管中，再在管中加入100μL磷酸鹽緩沖溶液（PBS）進(jìn)行混合，將EP管至于高速離心機(jī)12000r/min離心3min，棄掉上清，按上述步驟用PBS對菌液進(jìn)行洗滌2～3次，洗滌后將EP管至于100℃沸水中水浴20min，12000r/min離心15min，吸上清于4℃冰箱保存，作為模板DNA。

PCR反應(yīng)體系：上游引物（10μM）0.5μL，下游引物（10μM）0.5μL、模板DNA1μL、TaqMasterMix（5u/μL）12.5μL，補(bǔ)水至總體積為25μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30個循環(huán);72℃終延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物加入1%瓊凝膠用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照保存。

2.4 大腸桿菌半數(shù)致死量（LD₅₀）的測定

將JS160810、ZD150808各菌株菌液分別稀釋至1.0×10⁹CFU/mL、1.0×10⁸CFU/mL、1.0×10⁷CFU/mL、1.0×10⁶CFU/mL、1.0×10⁵CFU/mL、1.0×10⁴CFU/mL、1.0×10³CFU/mL、1.0×10²CFU/mL、1.0×10¹CFU/mL的菌數(shù)分別腹腔注射小鼠，同時設(shè)生理鹽水的對照組，共注射190只小鼠，隨機(jī)分成19組，每組10只小鼠，每只0.2mL，同時設(shè)生理鹽水的對照組，在注射后第1-7天不同時間段對小鼠進(jìn)行觀察。

2.5 疫苗制備

將菌株JS160810和菌株ZD150808菌液利用甲醛溶液進(jìn)行滅活，甲醛溶液的終濃度為0.15%，將含有甲醛的菌液放置37℃空氣浴搖床中培養(yǎng)24h進(jìn)行滅活，將滅活后的菌液分別接種在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和改良Minca肉湯中，37℃培養(yǎng)48h檢查菌液滅活效果。將完全滅活的菌液進(jìn)行濃縮后與氫氧化鋁膠佐劑4：1混合，放入4℃冰箱保存，濃縮后疫苗含菌量為3×10¹⁰CFU/mL。

2.6 疫苗的安全性檢驗

將制備好的疫苗接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板和改良Min-ca肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2天，觀察有無細(xì)菌生長。取10只小自鼠，分別皮下注射疫苗，0.5mL/只;觀察10天，記錄食欲及精神狀態(tài)。

本實驗共分成四組進(jìn)行免疫，分別是Group1（免疫劑量3.0×10⁹CFU/只）;Group2（免疫劑量9.0×10⁹CFU/只）;Group3（免疫劑量1.5×10¹⁰CFU/只）;氫氧化鋁膠佐劑對照組（Control 0.1mL/只），每組20只小白鼠共計80只小白鼠，采用皮下多點注射，共免疫3次，免疫間隔時間為21天。Group1、Group2、Group3、Control每組各取10只小鼠進(jìn)行重新分組，分成兩個攻毒組每組40只小鼠，用2×LD₅₀活菌液ZD150808和2×LD₅₀活菌液JS160810對兩個攻毒組分別攻毒，攻毒時間為三次免疫結(jié)束后第10天，攻毒后觀察7天內(nèi)小鼠的發(fā)病及死亡情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 疫苗的無菌及安全性檢驗結(jié)果

結(jié)果均無任何微生物生長。小鼠接種10天后全部健康存活，注射氫氧化鋁膠佐劑疫苗的小鼠注射部位皮膚上有腫塊，無化膿現(xiàn)象。

3.2 細(xì)菌鏡檢結(jié)果

細(xì)菌為兩端鈍圓的革蘭氏陰性短小桿菌，個別菌體可呈近似橢圓形，多單獨或成對存在，不形成芽胞符合大腸桿菌形態(tài)特異性

3.3 生化試驗結(jié)果

這兩株菌均符合大腸桿菌的生化特性，具體結(jié)果見表2。

3.4 PCR檢測結(jié)果

JS160810大腸桿菌F41、Sta、K99基因分別在431bp、314bp、163bp處有清晰條帶，與預(yù)期目的片段大小相符，見圖1。ZD150808大腸桿菌irp2、fyuA、Stx1基因分別在953bp、531bp、301bp處有清晰條帶，與預(yù)期目的片段大小相符，見圖2。

3.5 大腸桿菌半數(shù)致死量檢測結(jié)果

大腸桿菌JS160810的LD₅₀為1.78×10⁵CFU，大腸桿菌ZD150808的LD₅₀為2.51×10⁵CFU。

3.6 最佳免疫劑量確定及攻毒保護(hù)試驗結(jié)果

以大腸桿菌JS160810攻毒后Group1在7天內(nèi)死亡6只小鼠Group2在7天內(nèi)死亡4只小鼠Group3在7天內(nèi)死亡2只小鼠，以大腸桿菌ZD150808攻毒后，Group1在7天內(nèi)死亡7只小鼠，Group2在7天內(nèi)死亡6只小鼠Group3在7天內(nèi)死亡2只小鼠，Gro叩3中小鼠存活率都很高，且保護(hù)率均為80%。

4 討論

該病一年四季均可發(fā)生，犢牛和羔羊多發(fā)于冬、春舍飼期間[6-7]。一旦發(fā)生，病死率很高，有的甚至能夠達(dá)到100%;牛、羊發(fā)病時一般呈散發(fā)性或地方流行性。大腸桿菌腸毒素的類型分為耐熱型腸毒素（ST）和不耐熱腸毒素（LT）兩類，將它們制成雙聯(lián)苗后，可以抵抗各類產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）感染[8]。一般來說，動物源性的ETEC菌株只產(chǎn)生ST[9]。據(jù)調(diào)查，引起犢牛、羔羊腹瀉的ETEC黏附素中 K99和F41相加占50%以上[10]。本試驗利用從黑龍江省部分市區(qū)腹瀉犢牛的病料中分離、篩選出的2株致病性大腸桿菌菌株，研制出牛大腸桿菌病滅活苗，病料采集范圍廣泛，涵蓋黑龍江地區(qū)各主要規(guī)模化養(yǎng)牛場，分離的菌株具有一定的代表性和普遍性，這些都為針對地區(qū)流行的牛大腸桿菌病疫苗的研制奠定了良好基礎(chǔ)，經(jīng)動物實驗證明研制出的地方株大腸桿菌病滅活苗具備較好的保護(hù)效果。研究表明，改良Minca肉湯培養(yǎng)的抗原所制備的免疫血清效價高，抗體維持時間長[11]。這是由于液體培養(yǎng)條件下菌株的各種生物學(xué)性狀得到充分表達(dá)。因此，本試驗采用了液體培養(yǎng)法對疫苗抗原進(jìn)行培養(yǎng)。要全面有效地控制大腸桿菌病，在采用疫苗免疫的同時還應(yīng)采取綜合性防治措施，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高犢牛抗體水平和減少應(yīng)激等。

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