熊去氧膽酸生產中相關物質的分析

謝 強, 王 坤, 陶家林

(1. 四川大學 生物治療國家重點實驗室,四川 成都 610041；2. 中國科學院 成都有機化學有限公司，四川 成都 610041)

·研究簡報·

熊去氧膽酸生產中相關物質的分析

謝 強1,2, 王 坤2, 陶家林2

(1. 四川大學 生物治療國家重點實驗室,四川 成都 610041；2. 中國科學院 成都有機化學有限公司，四川 成都 610041)

建立了HPLC-示差折光檢測器外標法測定熊去氧膽酸中4種特殊雜質及其他有關物質含量的方法，結果表明各樣品在測定范圍內線性關系良好(r=0.999 1～0.999 6)，方法回收率、精密度、穩定性、重復性均符合要求，適用于熊去氧膽酸生產的質量控制。

熊去氧膽酸; 鵝去氧膽酸; 7-酮基石膽酸; 高效液相法; 示差檢測器; 分析

熊去氧膽酸(UDCA)是名貴中藥熊膽的主要有效成分，主要用于膽結石、原發性硬化性膽管炎、病毒性肝炎等多種膽汁淤積性肝病的治療，是美國FDA批準治療原發性膽汁性肝硬化(PBC)的唯一藥物[1-3]。該藥物同時也是唯一用于肝臟移植術中提高手術成活率的藥物，屬于消化內科重要的臨床治療藥物。

目前熊去氧膽酸的制備主要采用鵝去氧膽酸(CDCA)化學合成，在生產和貯存過程中主要有以下雜質：7-酮基膽石酸(7K-LCA)、膽酸(CA)和膽石酸(LCA)(Chart 1)[4-5]。研究結果表明雜質成分如膽石酸可能引起一些不良反應[6]。因此對熊去氧膽酸的質量控制在安全用藥上顯得尤為重要。當前關于熊去氧膽酸的分析,主要有TLC法、氣相色譜法和HPLC法?！吨袊幍洹?015年版中采用酸堿滴定法測定熊去氧膽酸含量，對有關物質采用薄層色譜法檢測，專屬性和靈敏度有一定局限性[7-9]。相關文獻中采用HPLC-UV法，但熊去氧膽酸等膽酸類組分紫外吸收較弱，最大吸收波長均處于末端吸收[10-11]。

Chart 1

為了有效檢出熊去氧膽酸中的相關雜質，更好地控制其質量，本文建立了熊去氧膽酸有關物質檢測的HPLC-RID法，能同時測定熊去氧膽酸中4種特殊雜質及其他有關物質含量，該法具有簡便、快速、準確等優點，適用于熊去氧膽酸的質量控制。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

日本島津LC-20AD型高相液相色譜儀；島津RID-20A型示差檢測器；Anlais3010型工作站。

膽酸(98%)和膽石酸(98%)，麥卡希試劑；7-酮基石膽酸(98.5%)，自制；鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸對照品由中國藥品生物制品檢定所提供；熊去氧膽酸樣品由中國科學院成都有機化學有限公司大邑分公司提供，批號：UD-151224、151226、151230；水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，磷酸氫二鈉和磷酸為分析純。

1.2 分析方法

(1) 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流動相:0.02 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液(用磷酸調節pH=3.0)/甲醇/乙腈(30/40/30)，流速：1 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣量20 uL。按外標法計算供試品中已知雜質含量，以熊去氧膽酸的峰面積計算其他未知雜質含量。

(2) 溶液配制

對照品溶液的配制：精密稱取熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、膽酸、7-酮基石膽酸、膽石酸對照品，用甲醇溶解，用流動相配成含熊去氧膽酸4 mg·mL-1、鵝去氧膽酸2 mg·mL-1、膽酸1 mg·mL-1、7-酮基石膽酸1 mg·mL-1、膽石酸0.5 mg·mL-1的溶液，作為對照品貯備液。精密量取貯備液各1 mL，用流動相定容至10 mL，作為對照品溶液。

樣品溶液的配制：取樣品適量，用甲醇溶解，用流動相稀釋為40 mg·mL-1。

2 結果與討論

2.1 系統適用性

取對照品溶液，按上述色譜條件進樣，記錄色譜圖(圖2)，系統適用性結果見表1。從表1可以看出，各樣品的分離度均1.5，符合藥典基線分離要求，且極性最弱的膽石酸出峰時間較快，總分析時間不超過15 min，系統適用性好。

Time/min圖2 對照品的高效液相色譜圖Figure 2 HPLC chromatogram of standard表1 系統適用性結果Table 1 Results of system suitability

組分保留時間理論塔板數分離度熊去氧膽酸5.6006396膽酸6.52577543.2187-酮基膽石酸7.07082161.796鵝去氧膽酸8.62279704.456膽石酸12.85786689.047

2.2 線性范圍和檢測線

分別精密量取對照品貯備液，分別用甲醇溶解制成一系列濃度標準溶液(熊去氧膽酸：0.1, 0.3, 0.6, 1.0, 2.0 mg·mL-1；膽酸： 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 mg·mL-1；7-酮基膽石酸：0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 mg·mL-1)；鵝去氧膽酸：0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.80 mg·mL-1；膽石酸：0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 mg·mL-1，按質量濃度由低到高分別進樣20 μL，記錄峰面積以濃度x(mg·mL-1)對峰面積y作標準曲線，回歸得到線性方程，結果見表2。由表2可見，各組分在測定范圍內線性關系良好，符合定量要求。

表2 熊去氧膽酸及相關雜質的回歸方程和檢測范圍Table 2 Linear functions and detection limits of ursodeoxycholic acid and its related substances

2.3 精密度

在上述色譜條件下，取各組分對照品溶液20 uL，重復進樣5次進行測試。熊去氧膽酸 、7-酮基膽石酸、鵝去氧膽酸、膽酸及膽石酸峰面積RSD分別為0.32%， 1.31%， 0.76%， 1.15 %， 1.05%(n=5)，說明系統穩定性良好。

2.4 重復性

精密稱取熊去氧膽酸樣品(UDCA-151224) 5份,按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液,5次重復測定結果見表3。由表3可看出該方法重復性良好。

表3 重復性試驗結果Table 3 Results of repeated tests

2.5 穩定性

精密吸取供試品溶液,在0, 2, 4, 6, 8 h 按色譜條件進樣測定,峰面積 RSD分別為1.6%, 1.1%, 1.2%和1.3%,表明8 h內樣品各成分穩定性良好。

2.6 有關物質測定

對3批樣品(UD-151224、UD-151226、UD-151230)分別進行測定，結果見表4。由表4可以看出，這三批樣品中均未檢出膽酸和膽石酸，主要雜質為鵝去氧膽酸和7-酮基膽石酸，其他未知雜質含量均小于2.5‰，符合歐洲藥典EP6.0要求，其中UD-151230的最大單個雜質小于0.1‰，符合歐洲藥典EP7.0要求。

表4 熊去氧膽酸中各有關物質的測定結果(%)*Table 4 The detection results of related substances(%)

*-表示未檢出；a其他最大單個雜質

參照《中華人民共和國藥典》(二部)中記載的方法及相關文獻，建立了一種能同時測定熊去氧膽酸中主要成分熊去氧膽酸以及主要雜質鵝去氧膽酸、7-酮基石膽酸、膽酸和膽石酸的含量的HPLC-RID方法。方法回收率、精密度、穩定性、重復性均符合要求，適用于熊去氧膽酸生產的質量控制。

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Analysis of Related Substances in The Production of Ursodeoxycholic Acid

XIE Qiang1,2, WANG Kun2, TAO Jia-lin2*

(1. State Key Laboratory of Biotechnology, Sichuan University， Chengdu 610041, China 2. Chengdu Organic Chemicals Co., LTD., Chinese Academy of Sciences， Chengdu 610041, China)

A HPLC-refractive index detector method for determination of four special substances and other substances in the production of Ursodeoxycholic acid was established. Determination of the impurity possesses good linearity(r=0.999 1～0.999 6), and the method of recovery, precision, stability and repeatability meet standards. The method is suitable for the quality control of Ursodeoxycholic acid production.

Ursodeoxycholic acid; Chenodeoxycholic acid; 7-ketolithocholic acid; high performance liquid chromatography; refractive index detector; analysis

2016-11-01

謝強(1986-)，男,漢族，四川彭州人，助理研究員，主要從事膽酸類化合物的提取分離及結構改造等研究。E-mail:vvxq@hotmail.com

陶家林，研究員， Tel. 028-85217603, E-mail： jialint@cioc.ac.cn

O657.7; O629.22

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.02.16279