寄生軟化湯誘導(dǎo)骨肉瘤小鼠的免疫效應(yīng)

李森　王健　古欽文　彭道琥

摘要 目的：探討寄生軟化湯對(duì)骨肉瘤小鼠免疫功能的誘導(dǎo)作用，為腫瘤的中藥輔助治療提供參考。方法：選取昆明種小鼠，隨機(jī)分為模型給藥組、模型組、空白模型組、正常組，其中模型給藥組腹腔注射給予25mg/kg順鉑及給予13mg/kg寄生軟化湯灌胃，模型組給予相同劑量的順鉑和生理鹽水，空白模型組和正常組分別給予相同劑量的生理鹽水。療程結(jié)束后統(tǒng)計(jì)分析小鼠體重、腫塊近似體積、臟器指數(shù)及T細(xì)胞亞群。結(jié)果：與模型組比較，寄生軟化湯可明顯提高骨肉瘤小鼠的體重及CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+比值（P<0.05）。運(yùn)用寄生軟化湯的小鼠較模型組腫塊體積減少，胸腺和脾臟指數(shù)增加，但變化并不顯著。結(jié)論：寄生軟化湯對(duì)骨肉瘤小鼠的免疫功能具有調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)作用。中藥與化療聯(lián)合治療腫瘤可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，抑制腫瘤生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞 寄生軟化湯；骨肉瘤；免疫功能；誘導(dǎo)作用；T細(xì)胞亞群；中藥；化療；聯(lián)合治療

AbstractObjective：ToinvestigatetheimmuneinducingactivityofJishengRuanhuaDecoctiononmicewithosteosarcomaandtoprovidereferencesforsynergetictreatmentoftumorwithtraditionalChineseMedicine.Methods：Kunmingmicewererandomlydividedintomodeladministrationgroup，modelgroup，blankmodelgroupandnormalgroup.Themodeladministrationgroupreceivedintraperitonealinjectionof25mg/kgcisplatinandintragastricadministrationof13mg/kgJishengRuanhuaDecoction，andthemodelgroupwasadministratedthesamedosagesofcisplatinandsalinewiththeblankmodelgroupandthenormalgroupbeinggiventhesamedosageofsalinerespectively.Aftertheendofthetreatmentcourse，thebodyweight，approximatevolumeoftumor，organsindexandTcellsubgroupswerestatisticallyanalyzed.Results：Comparedwiththemodelgroup，JishengRuanhuaDecoctioncouldsignificantlyincreasethebodyweightandthepercentageofCD3+Tcell，CD4+Tcell，CD8+TcellandCD4+/CD8+ratioofthemicewithosteosarcoma（P<0.05）.Furthmore，JishengRuanhuaDecoctionreducedthevolumeofthetumorandimprovedtheindexofthymusorspleenwithnoremarkablechanges.Conclusion：JishengRuanhuaDecoctioncouldregulateandinduceimmunefunctionofmicewithosteosarcoma.ThecombinationtreatmentofchemotherapyandtraditionalChinesemedicineenhancedtheimmunefunctionandinhibitedtumorgrowth.

KeyWordsJishengRuanhuaDecoction；Osteosarcoma；Immunefunction；Inducingactivity；Tcellsubgroups；TraditionalChinesemedicine；Chemotherapy；Combinationtreatment

中圖分類(lèi)號(hào)：R289.5；R738.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.050

骨肉瘤是兒童和青少年時(shí)期最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，伴有骨惡性度高、生長(zhǎng)迅速、早期易轉(zhuǎn)移且治療后易復(fù)發(fā)等臨床癥狀而成為醫(yī)學(xué)上的一大難題[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，即使采用現(xiàn)有的化療/放療及西醫(yī)輔助治療方案，骨肉瘤患者10年總生存率也僅有60%～70%，且在診斷時(shí)，約20%骨肉瘤患者已發(fā)生轉(zhuǎn)移性疾病，嚴(yán)重影響人類(lèi)的健康水平和生命質(zhì)量，因此探尋延緩病程，改善疾病癥狀，提高生命質(zhì)量的治療方案迫在眉睫[3-5]。中醫(yī)藥與西醫(yī)相比在對(duì)調(diào)理患者的全身狀況，降低化療的不良反應(yīng)，提高手術(shù)和化療的效果，調(diào)整臟腑失調(diào)，提高患者的免疫力等方面具有其獨(dú)到之處[6]。本研究旨在通過(guò)統(tǒng)計(jì)治療療程結(jié)束后骨肉瘤小鼠體重、腫塊近似體積、臟器指數(shù)及T細(xì)胞亞群的變化，分析其免疫狀態(tài)，進(jìn)而探討寄生軟化湯對(duì)骨肉瘤小鼠免疫功能的影響，為中藥輔助治療腫瘤提供臨床依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物昆明種小鼠30只，SPF級(jí)，雄性，6～8周齡，體重（20.0±2.1）g，購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2藥物寄生軟化湯包括黨參12g、黃芪12g、白術(shù)9g、木香6g、川續(xù)斷15g、狗脊12g、桑寄生12g、丹參15g、當(dāng)歸9g等多味中草藥。上述中藥水煎2次，濃縮至100mL，置于-4℃冷藏儲(chǔ)存。寄生軟化湯中草藥均購(gòu)于廣州市中醫(yī)醫(yī)院。順鉑購(gòu)于南京制藥廠(chǎng)有限公司。

1.1.3試劑與儀器LM8骨肉瘤細(xì)胞株購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。新生牛血清RPMI1640培養(yǎng)液（含10%新生牛血清）為美國(guó)GIBCO產(chǎn)品。小鼠CD3+、CD4+、CD8+單克隆抗體購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。EliteESP型流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)Coulter公司。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備LM8骨肉瘤細(xì)胞株置于RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)生長(zhǎng)至90%融合時(shí)采用胰酶消化后計(jì)數(shù)，離心后棄上清，加PBS緩沖液混勻調(diào)整骨肉瘤細(xì)胞濃度為20×106個(gè)/mL。

實(shí)驗(yàn)分為模型給藥組、模型組、空白模型組、正常組。隨機(jī)選取24只小鼠，剪去左前腋下毛發(fā)，并采用碘液進(jìn)行消毒處理。取LM8骨肉瘤細(xì)胞懸液0.25mL，注入小鼠左前腋窩皮下。皮下注射后每天肉眼觀察，具有明顯腫瘤結(jié)節(jié)時(shí)為造模成功。

1.2.2給藥方法造模成功后開(kāi)始給藥，其中模型給藥組分別2次/d腹腔注射給藥25mg/kg順鉑（w/w，2.5mg/mL）及1次/d灌胃給藥13mg/kg寄生軟化湯（根據(jù)給藥劑量換算，相當(dāng)于臨床成人用量的9倍）。模型組分別給予相同劑量的順鉑和生理鹽水，空白模型組和正常組給予相同劑量的生理鹽水。連續(xù)給藥28d為1個(gè)療程。每只小鼠每日灌胃量不超過(guò)1.0mL。

1.2.3檢測(cè)指標(biāo)與方法治療療程結(jié)束后稱(chēng)取小鼠體重，測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑a和橫徑b，并依據(jù)公式V=πab2/6，計(jì)算腫塊的近似體積。實(shí)驗(yàn)小鼠摘眼球取血，采用肝素鈉震蕩進(jìn)行抗凝處理，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定T細(xì)胞亞群CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分率。實(shí)驗(yàn)小鼠取血后脫臼處死，摘取完整的胸腺和脾臟，濾紙吸干殘血后稱(chēng)取質(zhì)量，依據(jù)臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體重×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1寄生軟化湯對(duì)小鼠體重及腫塊體積的影響

腫瘤對(duì)小鼠體重具有抑制作用，正常組小鼠體重與模型小鼠比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型給藥組小鼠體重上升，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且小鼠自主活動(dòng)增加，皮毛具有一定的光澤，表明寄生軟化湯對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。腫塊近似體積數(shù)據(jù)顯示，模型給藥組、模型組腫塊體積與空白模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但模型給藥組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.2寄生軟化湯對(duì)小鼠免疫功能的影響

2.2.1寄生軟化湯對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響模型小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與正常小鼠相比均有下降。與空白模型組比較，模型組小鼠臟器指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而模型給藥組臟器指數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.2.2寄生軟化湯對(duì)小鼠T細(xì)胞亞群的影響與正常組比較，模型小鼠CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分率均顯著下降，表明腫瘤損傷機(jī)體免疫功能。與模型組比較，模型給藥組CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+比值均顯著增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此外，模型組小鼠CD8+T細(xì)胞百分率、CD4+/CD8+比值與空白模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3討論

骨肉瘤患者，尤其是中晚期的化療患者，其自身的免疫功能紊亂低下，而傳統(tǒng)化療對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)又具有明顯的抑制作用，給疾病的預(yù)后及治療帶來(lái)諸多困難[7-8]。中藥輔助化療可明顯緩解腫瘤患者的臨床癥狀，改善生命質(zhì)量及治療耐受性，并在一定程度上控制腫瘤大小，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間，為腫瘤治療提供新的思路與方法[9-11]。中藥可通過(guò)激發(fā)、增強(qiáng)或恢復(fù)機(jī)體特異性或非特異性免疫效應(yīng)機(jī)制，促進(jìn)T細(xì)胞因子釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制血管生成，增加T細(xì)胞總數(shù)等途徑達(dá)到抗腫瘤作用[12-13]。

寄生軟化湯作為治療骨肉瘤的中藥方劑，具有活血消腫，攻堅(jiān)散結(jié)，減毒增效的療效，其含有多味補(bǔ)益正氣，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的中草藥，如黨參、黃芪、白術(shù)、丹參等。單味中草藥夏枯草的提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[14]。Usami等[15]報(bào)道顯示丹參提取物人參皂苷可以增加小鼠胸腺質(zhì)量，抑制腫瘤細(xì)胞新生血管的形成和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。任杰紅等[16]和孫睿等[17]研究人員發(fā)現(xiàn)人參皂苷可以提高正常小鼠胸腺和脾臟質(zhì)量，提高機(jī)體免疫活性。本實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，寄生軟化湯可以明顯提高骨肉瘤模型小鼠的體重（P<0.05），使小鼠自主活動(dòng)增加，皮毛具有一定的光澤。此外，口服寄生軟化湯的模型小鼠腫瘤體積減小，胸腺和脾臟指數(shù)增加。同時(shí)接受寄生軟化湯和化療治療的小鼠CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+比值與單一化療的模型組比較均顯著增加（P<0.05），這表明寄生軟化湯對(duì)骨肉瘤小鼠的免疫功能具有誘導(dǎo)作用，寄生軟化湯與化療聯(lián)合治療與單一化療比較，聯(lián)合治療的抗腫瘤效果更佳。

任一時(shí)期的患者，即使是晚期惡性程度比較高的腫瘤患者，中醫(yī)治療也能起到提高患者生命質(zhì)量，延長(zhǎng)生命的作用。其用在手術(shù)前后也能有很好的治療效果，防止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散，提高手術(shù)的成功率，減少發(fā)生相應(yīng)的并發(fā)癥[18-20]。用在放療和化療后可以減少其不良反應(yīng)，提升患者自身的免疫力，幫助患者完成整個(gè)治療過(guò)程，提高治愈的概率。中醫(yī)治療采用藥的藥物通常是純天然的中草藥，藥性較溫和且無(wú)刺激，可以貫穿于患者整個(gè)治療的過(guò)程。

實(shí)驗(yàn)研究表明，化療與中藥聯(lián)合治療在增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，改善患者臨床癥狀和生命質(zhì)量等諸多方面具有一定的療效。李梅等[21]在探討中藥湯劑辨證施治聯(lián)合生長(zhǎng)抑素類(lèi)似物治療晚期胃腸胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的療效及安全性實(shí)驗(yàn)中證實(shí)中藥湯劑辨證施治與生長(zhǎng)抑素類(lèi)似物在治療晚期胃腸胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤方面具有協(xié)同作用，可減輕用藥不良反應(yīng)，可能延長(zhǎng)患者的疾病進(jìn)展時(shí)間。張江華等[22]研究表明環(huán)磷酰胺聯(lián)合中藥治療具有抗癌、減輕骨髓抑制作用，拮抗環(huán)磷酰胺的不良反應(yīng)及進(jìn)一步延長(zhǎng)荷瘤小鼠壽命的作用。此外，很多中藥單體聯(lián)合應(yīng)用西藥能調(diào)節(jié)P53、Bcl-2基因家族、c-myc等細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)，從而有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[23-25]。

綜上所述，寄生軟化湯對(duì)骨肉瘤小鼠的免疫功能具有調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)的作用，采用中藥與化療聯(lián)合的方法治療腫瘤可改善患者的生命質(zhì)量，抑制腫瘤的生長(zhǎng)，增強(qiáng)患者的免疫功能，為腫瘤的中藥輔助治療提供了重要的臨床參考。

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（2017-12-21收稿責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）