糖腎方對db/db小鼠腎臟纖維化的保護作用

劉鵬 陳姣伊 劉言振?┱棗面? 張浩軍 嚴美花 趙海玲 李平

摘要 目的：觀察糖腎方（TangShenFang，TSF）對于自發性2型糖尿病腎病db/db小鼠腎臟纖維化的保護作用。方法：8周齡雄性db/db小鼠隨機分為2組，分別為模型組（db/db）和觀察組（db/db+TSF），每組9只；8周齡雄性db/m小鼠為正常對照組（db/m），順應性喂養2周后，給予糖腎方干預12周，處死小鼠，分離小鼠腎臟用于后續檢測。利用PAS和Masson染色觀察腎臟病理；利用WesternBlotting、Real-timePCR和免疫組化等技術檢測腎臟組織纖維化TGF-β1/Smad3通路以及miRNA21和miRNA29b的表達。結果：糖腎方可以改善db/db小鼠尿微量白蛋白水平，減輕小鼠腎臟損傷；WesternBlotting、Real-timePCR和免疫組化結果顯示，糖腎方可下調db/db小鼠腎臟中纖維化標志分子TGF-β1、Smad3、CollagenⅠ和Fibronectin的表達；下調db/db小鼠腎臟miRNA21的表達，上調miRNA29b的表達。結論：糖腎方可作用于TGF-β1/Smad3信號通路抑制腎臟纖維化。

關鍵詞 糖腎方；糖尿病腎病；腎臟纖維化；miRNA

AbstractObjective：ToobservetheeffectsofTangshenFormula（TSF）treatmentonrenalfibrosisandexploreitspotentialmechanismindb/dbmice.Methods：Eightweeksolddb/dbanddb/mmicewererandomlydividedintothreesubgroups，（db/m，db/db，db/db+TSF），andallmicewerefedwithanormaldiet.Aftertwoweeksadaptation，miceweremaintainedonTSFtreatmentfor12weeksandwerethensacrificedunderanesthesiaafterovernightfast.Animalurineandrenaltissuessampleswerecollectedforfurtheranalyses.ThekidneyswerewashedwithcoldPBSsolution；onepartoftherenaltissuewerestoredinliquidnitrogen，andanotherdeposited-80℃directlyforsubsequentfrozensections；therestofthekidneywerefixedintotheneutralformalinforpathologicalanalysis.TherenalfibrosiswasdetectedbyPASandMassonstaining.TherenalexpressionofTGF-β1/Smad3anditstargetgeneswereassessedbyWesternBlotting，real-timePCR，andIHC.Results：TSFdiminishedUACRofdb/dbmice.HistologicalanalysisusingPASandMassonstainingrevealedtheoccurrenceofmesangialmatrixexpansionandextracellularmatrixdepositioninthekidneysofdb/dbmice.ThetreatmentwithTSFsignificantlyamelioratedthesehistologicalrenalinjuriesindb/dbmice.WesternBlottingandreal-timePCRanalysisshowedthatexpressionlevelsofTGF-β1，Smad3，CollagenⅠandFibronectinweresignificantlydownregulatedinthedb/dbmicewithTSFtreatment.WithTSFtreatment，theexpressionlevelsofmiRNA21wasdownregulated，buttheexpressionlevelsofmiRNA29bwasupregulated.Conclusion：TSFattenuatedrenalfibrosisindb/dbmice，throughsuppressionofTGF-β1/Smad3pathway.

KeyWordsTangshenformula；Diabeticnephropathy；Renalfibrosis；miRNA

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.010

糖尿病腎病（DiabeticNephropathy，DN）是糖尿病（DiabetesMellitus，DM）主要的微血管并發癥之一，已成為發達國家和我國發達地區終末期腎病（EndStageRvenalDisease，ESRD）的主要原因[1-2]。DN主要病理改變是由于細胞外基質的過度沉積，腎小球基底膜的厚度增加，進而導致系膜增殖和擴張，最終發展成為腎小球硬化和腎臟纖維化，喪失正常的功能。在DN的早期階段（微量白蛋白尿階段），膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白在腎小球基底膜和系膜細胞外基質中的沉積明顯增加，導致糖尿病彌漫性腎小球硬化癥；在晚期階段，腎臟中Ⅰ型和Ⅲ型膠原明顯沉積[3]。由此可見，纖維化是DN腎臟病理的最主要特征。轉化生長因子-β1（TGF-β1）是一種廣譜細胞因子，可被高血糖、晚期糖基化終產物（AdvancedGlycationEnd-products，AGEs）、促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedProteinKinase，MAPK）和蛋白激酶C（ProteinKinaseC，PKC）等多種途徑誘導，在導致DN纖維化過程中發揮著決定性的作用[4]。多項研究表明TGF-β1/Smad3信號通路是引起糖尿病腎病腎臟纖維化的重要通路，此外TGF-β1還可通過調控一些微小RNA（MicroRNA，miRNA）進一步引起腎臟損傷（如：miRNA21，miRNA29等）[5-6]。因此，TGF-β/Smad3信號通路已成為防治DN的重要靶點之一。

目前的治療方案尚不能產生顯著的療效，因此迫切需要新的治療方法來減緩DN的進展[7]。中醫藥是祖國瑰寶，同時國內的糖尿病腎臟疾病（DiabeticKidneyDiseases，DKD）患者廣泛接受中醫藥的治療[8]。中藥糖腎方（TangshenFormula，TSF）顆粒是由七味藥組成，分別為黃芪、生地黃、山茱萸、三七、衛矛、熟大黃和枳殼，是李平教授團隊在繼承名老中醫經驗基礎上，結合自身臨床實踐和現代研究成果擬定的中藥復方。在國家“973計劃”和國際科技合作等項目資助下，課題組前期多中心臨床試驗證實糖腎方可以減少DKD患者尿蛋白排泄率，改善腎小球濾過率[9]。本研究主要探討糖腎方對于腎臟纖維化的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物雄性自發性2型糖尿病db/db小鼠，8周齡，體重（35±5）g；同遺傳背景db/m小鼠，體重（20±2）g，購自北京大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（京）2011-0001。小鼠均飼養于中日友好醫院SPF級實驗動物室屏障環境，使用許可證號：SYXK（京）2010-0011。溫度：（23±3）℃，相對濕度（55±15）%，保持12h光照/12h黑暗交替，自由飲水和常規飼料喂養。本次實驗所有操作均嚴格按照實驗動物倫理相關規定進行。

1.1.2藥物糖腎方配方顆粒，由江陰天江藥業有限公司制劑，規格：8g/袋，批號：1206346。糖腎方組成藥物為：黃芪、衛矛、生地黃、枳殼、山茱萸、大黃、三七7味中藥，其重量比依次為10∶5∶4∶3.4∶3∶2∶1。

1.1.3試劑與儀器小鼠白蛋白Elisa試劑盒（美國BethylLaboratories公司）；iQTMSYBRGreensupermix（美國Bio-RAD公司）；蛋白預染Marker（中國天根生化科技有限公司）；PVDF膜（德國MerckMillipore公司）；CollagenⅠ抗體（美國SantaCruz公司）；Fibronectin抗體（美國SantaCruz公司）；Smad3抗體（美國CellSignalingTechnology公司）；P-Smad3抗體（美國CellSignalingTechnology公司）；β-actin抗體（美國SantaCruz公司）；辣根酶標記兔抗小鼠IgG（美國DAKO公司）；Trizol試劑（美國SantaCruz公司）；QuickstartBradfordDyeReagent（美國Bio-RAD公司）；TaqmanmiRNA試劑盒（美國ThermoFisher公司）；BSA（美國Amresco公司）。CD-1600全自動生化分析儀（美國雅培公司）；BX43型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；多功能酶標儀（美國ThermoFisher公司）；PH儀（美國ThermoFisher公司）；垂直凝膠電泳系統（美國Bio-RAD公司）；Nanodrop高精度核算分光光度計（美國ThermoFisher公司）；PCR儀（美國Bio-RAD公司）；real-timePCR儀（美國Bio-RAD公司）。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備實驗動物購入后，順應性喂養2周，稱重并進行基礎狀態觀察，于10周齡時根據體重將db/db小鼠隨機分為2組。

1.2.2給藥方法動物分組后從第1天開始灌胃給藥，1次/d，每周稱重，連續給藥12周。糖腎方劑量參考前期臨床研究并按照標準動物劑量換算[10]，根據體重按照體表面積進行換算，糖腎方的臨床給藥劑量是16g/d，按照人的標準體重為60kg計算，小鼠體重按照20g計算，小鼠給藥劑量應為人給藥劑量的9倍，則小鼠給藥劑量為還是2.4g/（kg·d）[9]。糖腎方顆粒劑按照0.18g/mL的濃度進行配制，4℃保存，灌胃前取出恢復至室溫，混勻后備用。各組小鼠灌胃給藥方案如下表所示見，表1.1。

1.2.3標本采集實驗期間從給藥0周開始，每4周將小鼠轉移入代謝籠一次，小鼠禁食但不禁水，收集24h尿液后測定尿量，混勻后留取1.5mL，10000rpm4℃離心5min，留取上清液，保存于-80℃冰箱用于檢測尿白蛋白及尿肌酐水平。在給藥12周實驗結束時，小鼠禁食12h后，眼內眥取血，3000r/min4℃離心15min，留取上清液，保存于-80℃冰箱用于檢測各項生化指標。之后迅速打開小鼠腹腔，摘取雙側腎臟，分別稱重。一側腎臟去除髓質后，一半置于10%中性福爾馬林溶液中固定，另一半置于4%多聚甲醛中固定；另一側分離出腎皮質，迅速置于干燥凍存管中，于液氮保存。

1.2.4檢測指標與方法取尿液上清，檢測尿白蛋白濃度和尿肌酐；并計算尿白蛋白肌酐比值（UrineAlbumin-to-CreatinineRatio，UACR）。腎組織經過10%中性福爾馬林固定24h后，依次進行脫水、透明、石蠟包埋后，使用切片機分別切為3μm厚切片，進行過碘酸-雪夫（PeriodicAcid-Schiff，PAS）染色和Masson染色，光鏡下觀察腎臟組織病理變化，采用評分法對其進行半定量分析。采用WesternBlotting以及免疫組化法檢測腎臟組織中Smad3、P-Smad3、CollagenⅠ和Fibronectin的表達情況，采用Real-timePCR檢測腎臟組織中TGF-β1Smad3、CollagenⅠ和Fibronectin的mRNA水平以及miRNA21和miRNA29b的表達情況。

1.3統計學方法所有計量數據均以均數±標準誤（±s）表示，采用GraphPadPrism5.0軟件進行統計分析，采用One-wayANOVA分析和Dunnett-t多組間比較等檢驗方法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1糖腎方對db/db小鼠UACR的影響尿微量白蛋白是評價DN病情進展的重要指標，本研究中以尿肌酐進行校正，使用UACR作為評價病情進展。如圖1.1B所示。在10周齡實驗開始時，模型組db/db小鼠UACR顯著高于正常組db/m小鼠，而模型組與糖腎方組db/db小鼠UACR無明顯差異；從18周齡開始，在給予糖腎方干預后，db/db小鼠UACR顯著降低，抑制病情進展。圖1.1中，db/m表示正常對照組，db/db表示模型組，db/db+TSF表示糖腎方觀察組。

2.2糖腎方顯著改善db/db小鼠腎臟病理損傷腎臟組織經過PAS染色后，糖原在光鏡下呈紫紅色顆粒。如圖1.2A所示。正常組db/m小鼠腎小球的結構正常，系膜區陽性物質未見增多；模型組db/db小鼠腎小球官腔的結構異常，系膜區陽性物質明顯增多，同時伴有系膜基質顯著增生以及基底膜增厚；在給予糖腎方干預后，可明顯改善db/db小鼠腎小球系膜基質的増生及基底膜增厚，同時對腎小球系膜基質百分比進行半定量分析，結果具有統計學差異。見圖1.2B。

經過Masson染色后，膠原在光鏡下呈現藍色。如圖1.2C所示。正常組db/m小鼠腎小球和腎小管的結構正常，膠原表達未見增多；模型組db/db小鼠腎小球系膜區及基底膜膠原出現明顯的增生，同時出現腎小管擴張；給予糖腎方干預后，可明顯減少db/db小鼠腎小球及小管間質的膠原沉積，使用纖維化面積進行半定量分析，結果具有統計學差異。見圖1.2D。

2.3糖腎方對db/db小鼠腎臟皮質CollagenⅠ和Fibronectin蛋白及mRNA水平的影響如圖1.3所示，免疫組化檢測發現，模型組db/db小鼠腎臟皮質CollagenⅠ和Fibronectin白水平顯著高于正常組db/m小鼠，在給予糖腎方干預后，db/db小鼠腎臟皮質Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白水平顯著下降，結果具有統計學差異。見圖1.4所示。WesternBlotting檢測發現，模型組db/db小鼠腎臟皮質CollagenⅠ和Fibronectin蛋白水平顯著高于正常組db/m小鼠，在給予糖腎方干預后，db/db小鼠腎臟皮質Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白水平顯著下降。如圖1.5所示。Real-timePCR檢測發現，模型組db/db小鼠腎臟皮質Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白mRNA水平顯著高于正常組db/m小鼠，在給予糖腎方干預后，db/db小鼠腎臟皮質Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白mRNA水平顯著下降。

2.4糖腎方對db/db小鼠腎臟皮質TGF-β1/Smad3信號通路的影響如圖1.6所示，WesternBlotting檢測發現，模型組db/db小鼠腎臟皮質中Smad3蛋白磷酸化水平顯著高于正常組db/m小鼠，在給予糖腎方干預后，db/db小鼠腎臟皮質Smad3蛋白磷酸化水平顯著下降。如圖1.7所示，real-timePCR檢測發現，模型組db/db小鼠腎臟皮質中TGF-β1mRNA水平顯著高于正常組db/m小鼠，在給予糖腎方干預后，db/db小鼠腎臟皮質TGF-β1mRNA水平顯著下降。

2.5糖腎方對db/db小鼠腎臟皮質miRNA21和miRNA29b的影響miRNA是可以調節各項生命活動的小內源非編碼RNA，抑制目標基因翻譯和/或誘導mRNA降解，Smad3介導的miRNA（例如：miRNA21，miRNA29等）在糖尿病腎臟纖維化過程中發揮著重要作用。如圖1.8所示，real-timePCR檢測發現，模型組db/db小鼠腎臟皮質中miRNA21水平顯著高于正常組db/m小鼠，miRNA29b水平顯著低于正常組db/m小鼠；在給予糖腎方干預后，db/db小鼠腎臟皮質中miRNA21水平顯著下降，miRNA29b水平顯著升高。

3討論

我國已經成為了全球DM患者最多的國家，而且患病人數還在繼續增加，最新的研究顯示我國目前DM的患病率已經達到了10.9%，同時糖尿病前期的人口預計在35.7%[11]。DN作為DM主要的微血管并發癥之一，已成為ESRD的主要病因，嚴重威脅著人類的健康，給國家和社會造成了巨大的經濟負擔[1]。本研究發現糖腎方可顯著抑制TGF-β1/Smad3信號通路的表達，下調Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白的表達，減輕腎臟纖維化；此外研究還發現糖腎方還可通過下調腎臟中miRNA21的表達以及上調miRNA29b的表達，抑制腎臟纖維化的進展，保護腎臟功能。

TGF-β1/Smad3信號通路是引起糖尿病腎病腎臟纖維化的重要通路，可引起ECM的過度沉積，導致腎臟纖維化[6]。DN狀態下的許多物質，例如高血糖水平、AGEs及血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）都可上調TGF-β1的表達，并通過依賴及非依賴TGF-β1途徑激活Smad信號通路。Smad3可直接結合到膠原蛋白的啟動子區域，來上調膠原蛋白的表達，促進腎臟的纖維化進展[12-13]。同時降低成纖維細胞中的基質金屬蛋白酶-1（Matrixmetalloproteinase-1，MMP-1）活性，減少膠原蛋白的降解[14]。DN、UUO、高血壓腎損害及藥物導致的腎損害動物模型中，敲除Smad3均可抑制腎臟的纖維化[15-18]。TGF-β1/Smad信號通路導致腎臟纖維化的主要機制有：1）可通過誘導膠原和纖維連接蛋白的表達，直接引起ECM的過度沉積[19]；2）可誘導上皮細胞通過上皮-間質轉分化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT）轉化為肌成纖維細胞，誘導巨噬細胞通過巨噬細胞-肌成纖維細胞轉化肌成纖維細胞（Macrophage-myofibroblasttransition，MMT），以及誘導內皮細胞-間質轉分化（Endothelial-mesenchymaltransition，EndMT）為肌成纖維細胞[20-21]；3）可誘導腎小球系膜細胞分泌增強，導致系膜基質增多；還可誘導腎小管上皮細胞和足細胞的凋亡，影響腎臟正常的功能，加重腎臟的纖維化[22]；4）降低成纖維細胞中的MMP-1活性，減少膠原蛋白的降解[14]。所以，TGF-β1/Smad信號通路的激活可顯著促進腎臟纖維化的進展，可作為治療DN的潛在靶點。

在一項納入1604例DN患者的meta分析中發現，DN患者的血清和尿液中的TGF-β1含量顯著升高[23]。一些TGF-β1的抑制劑已經進行了臨床前和臨床研究，但由于不良反應以及療效不顯著等原因，還尚未得到廣泛的應用[24]。在一項有77例DN患者參與的隨機雙盲安慰劑對照研究中發現，一種可以阻斷TGF-β1啟動子的小分子藥物Pirfenidone，可延緩DN患者的腎小球濾過率（EstimatedGlomerularFiltrationRate，eGFR）的下降[25]。但在有36例激素抵抗型原發局灶性節段性腎小球硬化癥的隨機雙盲安慰劑對照研究中發現，給予人源的TGF-β1單克隆抗體fresolimumab（GC1008）后并未發現患者的eGFR有明顯改善[26]。

miRNA是可以調節各項生命活動的小內源非編碼RNA，長度為20～22個核苷酸，可與靶基因的3′端非翻譯區結合，抑制目標基因翻譯和/或誘導mRNA降解，其中一些miRNA（例如：miRNA21，miRNA29等）在糖尿病腎臟纖維化過程中發揮著重要作用[6]。miRNA21是被廣泛研究的miRNAs之一，早在2008年的一項研究中發現，心力衰竭模型中miRNA21可加重心臟的纖維化[27]。盡管在正常腎臟中miRNA21的含量比較低，但是在多種腎臟疾病模型中，例如糖尿病腎病和急性腎小球腎炎的動物模型中，均可發現miRNA21表達升高，腎臟發生纖維化改變[28-29]。已有大量研究表明，TGF-β1可上調miRNA21的表達；在敲除TGF-β1的糖尿病模型中，miRNA21的表達減少，腎臟纖維化程度減輕[30]。因此，miRNA21可成為改善纖維化相關疾病的重要靶點；在敲除miRNA21的小鼠模型中也進一步證實，敲除miRNA21后，可抑制腎臟的纖維化[31]。也有研究證實，miRNA21的表達是由Smad3調控的，Smad3的激活可以上調miRNA21的表達[29]。此外，miRNA21還可通過其他途徑促進腎臟纖維化，包括：1）miRNA21可抑制腎臟過氧化物酶體增殖物激活受體α（Peroxisomeproliferator-activatedreceptorα，PPARα）的表達，干擾正常的脂質代謝，引起腎臟脂質沉積，繼而導致腎臟纖維化改變[31]；2）激活腎臟中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）復合物1（mTORC1），促進纖維連接蛋白的表達，引起腎臟纖維化[32]。此外，在STZ誘導的糖尿病小鼠中發現，沉默miRNA21后，可改善小鼠的系膜擴張、腎間質纖維化及巨噬細胞浸潤，減少蛋白尿以及抑制腎臟的纖維化和炎性反應基因的表達[33]。

miR29是另一個被廣泛研究的miRNAs，miR29家族中包括miR29a、miRNA29b和miR29c3個成員，其所有成員均具有相同的序列并且都可結合到相同的目標基因，在臨床試驗和動物實驗中均發現miRNA29具有抗纖維化作用，還可抑制TGF-β1的轉錄[34]。在正常腎臟和肺中miRNA29b的表達較高，但當腎臟和肺發生纖維化改變時，miRNA29b的表達明顯降低[35-36]。在單側輸尿管梗阻（Unilateralureteralobstruction，UUO）小鼠模型中，腎臟出現纖維化改變，同時miRNA29b的表達降低；而在敲除Smad3的UUO小鼠模型中，腎臟纖維化程度明顯減輕，miRNA29b的表達也明顯升高，因此Smad3可抑制miRNA29b的表達[36]。由于miRNA29b可直接作用于I/III/IV型膠原蛋白、纖維連接蛋白和彈性蛋白的3′端非翻譯區，抑制其表達；在糖尿病腎病小鼠模型中，將db/db小鼠過表達miRNA29b后，其蛋白尿明顯減少，膠原蛋白和纖維連接蛋白表達減少，腎臟纖維化程度明顯減輕[37]。

因此，miRNA21及miRNA29b的表達與DN腎臟纖維化具有密切聯系，miRNA21及miRNA29b可作為治療DN的潛在靶點。在臺灣的DN患者中發現，其血清中的miRNA21含量明顯高于正常對照組，而miRNA29b含量明顯降低；隨著疾病的進展，miRNA21的表達逐漸提高，miRNA29b的表達逐漸降低；所以血清中的miRNA21及miRNA29b的含量可作為DN的進展期間的生物標志物[38]。

糖腎方作為臨床上治療DKD的經驗方，課題組前期研究已經證明其通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路改善STZ加單側腎切除大鼠腎臟纖維化[39]。本研究發現，給予糖腎方干預12周后，db/db小鼠腎臟皮質中Smad3的磷酸化程度降低，Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白及mRNA表達的下調，腎臟纖維化明顯減輕，表明糖腎方可減輕DN的腎臟纖維化保護腎臟功能。

綜上所述，糖腎方可抑制db/db小鼠腎臟TGF-β1/Smad3信號通路的表達，可能通過下調miRNA21的表達，同時上調miRNA29b的表達，顯著減輕腎臟纖維化進展保護腎臟功能。

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（2018-05-10收稿責任編輯：張文婷）