超高效液相色譜—串聯質譜法測定豬肉中 5種β—受體激動劑殘留

代立勤 崔銀倉

摘要 建立了豬肉樣中5種β-受體激動劑克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林和西馬特羅的超高效液相色譜-串聯質譜測定方法。樣品量取后，加入乙酸鈉水溶液，采用β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶酶解處理（37 ℃），過濾后，用MCX固相萃取柱凈化，采用UPLC-MS/MS 多反應監測（MRM）模式檢測，內標法定量。5種β-受體激動劑的檢出限均為0.125 μg/kg，定量下限為0.25 μg/kg，在0.25、0.5、1.0 μg/kg 3個濃度添加水平，總體平均回收率為83.3%～115.0%，總體相對標準偏差均在10%以內。本方法分析速度快，靈敏度高，重現性好，各項技術指標均滿足國內外相關法規要求，可用于各種動物源性樣品中5種β-受體激動劑殘留的快速檢測。

關鍵詞 受體激動劑；豬肉；超高效液相色譜-串聯質譜法

中圖分類號 TS251.7 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）13-0253-02

受體激動劑亦稱完全激動劑（full agonist），對受體有較強親和力和內在活性，能通過受體興奮發揮最大效應。β-受體激動劑，俗稱瘦肉精，是一類化學合成的結構和功能類似于腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類衍生物，包括非選擇性β-受體激動劑如異丙腎上腺素，選擇性心臟β1-受體激動劑如多巴酚丁胺，選擇性β2-受體激動劑如沙丁胺醇、叔丁、喘寧等。β2-受體激動劑可興奮氣道平滑肌和肥大細胞膜表面的β2-受體，其通過舒張氣道平滑肌、減少肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒及其介質的釋放、降低微血管的通透性、增加氣道上皮纖毛的擺動等途徑緩解哮喘癥狀。我國農業部1997年發文禁止瘦豬肉精在飼料和畜牧生產中使用，商務部自2009年12月9日起禁止進出口萊克多巴胺和鹽酸萊克多巴胺 。2001年12月27日及2002年2月9日、4月9日，農業部分別下文禁止使用β-激動劑類藥物作為飼料添加劑（農業部176號公告、193號公告、1519號條例）。β-受體激動劑具有苯乙醇胺結構母核，為苯乙醇胺類物質。按照苯環上取代基的不同，可分為苯胺型和苯酚型，而苯酚型β-受體激動劑又分為鄰苯二酚型、間苯二酚型及水楊醇型。目前，檢測β-受體激動劑的方法主要有高效液相色譜法[1]、氣相色譜質譜聯用法[2-4]、液相色譜質譜聯用法[5-10]及酶聯免疫法[11-12]等。本文主要對豬肉樣中的克倫特羅（Cl-enbuterol）、萊克多巴胺（Ractopamine）、沙丁胺醇（Salbut-amol）、西馬特羅（Cimaterol）和特布他林（Tulobuterol）進行了針對性的研究。β-受體激動劑的母核結構及此次研究的幾種化合物有以下種類。①苯酚型：沙丁胺醇，取代基位置為R1（CH2OH）、R2（OH）、R3（H）、R4（H）、R5（CH3）、R6（CH3）；萊克多巴胺，取代基位置為R1（H）、R2（OH）、R3（H）、R4（H）、R5（H）、R6（CH2-CH2-P-OH）；特布他林，取代基位置為R1（OH）、R2（H）、R3（OH）、R4（H）、R5（CH3）、R6（CH3）。②苯胺型：克倫特羅，取代基位置為R1（Cl）、R2（NH2）、R3（Cl）、R4（H）、R5（CH3）、R6（CH3）；西馬特羅，取代基位置為R1（H）、R2（NH2）、R3（N）、R4（H）、R5（CH3）、R6（H）。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY UPLC H-Class（美國Waters公司）；Xevo TQD質譜儀（美國Waters公司）；高速勻漿機（德國IKA）。

甲醇、乙腈、甲酸均為進口色譜純；β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶（德國Merck公司）；試驗用水為屈臣氏蒸餾水。

標準品：特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺和克倫特羅，純度均≥98.0%；克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3、特布他林-D9、西馬特羅-D7，純度均 ≥92.0%。

SPE小柱：MCX固相萃取柱（6 mL，500 mg），購自上海安譜公司。

1.2 標準溶液配制

標準（外標）儲備液（100 μg/mL）：準確稱取適量的特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫特羅對照品，用甲醇分別配制成100 μg/mL標準儲備液，置于0～5 ℃冰箱中保存，有效期為3個月。標準（內標）儲備液：克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3、特布他林-D9、西馬特羅-D7對照品，用甲醇分別配制成10 μg/mL的標準儲備液，0～5 ℃冰箱中保存，有效期為3個月。中間使用液：使用時用甲醇配制成100 ng/mL的混標溶液。基質標準曲線：選取空白豬肉樣，與樣品前處理步驟同步進行處理，最后用1.0 mL 0.1%甲酸溶液溶解，制成濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的混合標準工作液，其中內標濃度均為20 ng/mL。

1.3 樣品處理與凈化

1.3.1 酶解。準確量取2.0 g試樣，置于50 mL具螺旋蓋的聚丙烯離心管中，添加20 μL同位素內標工作液，加入10 mL乙酸鈉緩沖溶液（pH =5.2），然后加入50 μL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，充分振蕩混勻，37 ℃避光恒溫震蕩酶解16 h。

1.3.2 提取。酶解后放置至室溫，并渦旋混勻，在5 ℃條件下10 000 r/min高速離心5 min，收集上清液于50 mL離心管內，加入5 mL正己烷，渦旋混勻。5 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，棄去正己烷層。再向離心管中加入5 mL正己烷，渦旋混勻，5 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，棄去正己烷層，將離心管中的水相溶液立即經濾紙或者脫脂棉過濾，并用 5 mL乙酸鈉緩沖溶液洗滌濾紙，用10 mol/L NaOH溶液調pH值至9.5±0.2，待凈化。

1.3.3 凈化。將所得濾液全部加載在固相萃取柱（MCX）上，再依次用6 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液、6 mL水、6 mL 50%甲醇淋洗小柱，棄去淋洗液；負壓下抽干2 min，用5 mL洗脫液（甲醇∶氨水=95∶5）進行洗脫，收集洗脫液。洗脫液在50 ℃下氮吹吹干，加入1 mL 0.1%甲酸溶液溶解殘渣，樣液過0.2 μm濾膜后直接上機。

1.3.4 結果計算。內標法定量。

1.4 LC-MS/MS 條件

1.4.1 色譜條件。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC？誖 BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），Part No：186002350；流動相及梯度洗脫條件：流動相為0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液，以總體積為100%計算，流動相速度為0.25 mL/min；0～6.5 min，0.1%甲酸乙腈溶液所占比例由20%變化至90%，6.5～7.5 min，0.1%甲酸乙腈溶液所占比例由90%變化至25%，7.5～9.0 min，0.1%甲酸乙腈溶液所占比例由25%變化至67%，0～10 min，0.1%甲酸乙腈溶液所占比例由67%變化至20%，10～12 min，0.1%甲酸乙腈溶液所占比例不變。

1.4.2 質譜條件。電噴霧電壓：3.00 kV，離子源溫度：110 ℃；色譜柱溫度：30 ℃；洗脫溶劑溫度：350 ℃；氣體流量（N2）：650 L/h；錐孔氣流量（N2）：50 L/h；流動相流速：0.250 mL/min。

2 結果與分析

2.1 樣品基質效應的消除

動物性肉樣成分組成復雜，含有大量的脂肪和蛋白質等，如果前處理過程的提取、凈化中殘留過多的樣品基質，將會影響到分析檢測的靈敏度和準確性。因為樣品基質對離子電離有抑制作用，不同的基質往往造成的基質效應也不同。為消除樣品基質效應，在空白樣品中添加本次試驗研究的5種β-受體激動劑和對應的內標進行前處理，可使標樣和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而消除樣品的基質效應，提高分析結果的準確度。

通過使用標準物質進行調諧，不斷優化儀器條件，使每種物質的響應值達到要求的最低范圍，最終保證定性、定量、準確。表1為最終得到的質譜條件各項數值。

2.2 標準曲線和加標回收率

克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、西馬特羅標準品質量濃度在0.5～50.0 ng/mL范圍內，采用同位素內標法，分別以定量離子峰面積比值（定量離子峰面積與內標峰面積之比）為縱坐標，以質量濃度比值（化合物質量濃度與內標質量濃度之比）為橫坐標，繪制標準曲線。選取空白樣品進行加標回收率測定，選取0.25、0.5、1.0 μg/kg 3個濃度添加水平為最終測定濃度進行空白樣品添加，5種受體激動劑的回收率范圍為83.3%～115.0%（表2）。

2.3 方法檢出限定量限

方法檢出限按S/N=3 計算，5 種β-受體激動劑檢出限都可以達到0.125 μg/kg；定量限按照S/N=10 計算，5種β-受體激動劑檢測限都可以達到0.25 μg/kg，方法檢出限和定量限均滿足目前5種β-受體激動劑最大限量值檢測要求。

3 結論

本文建立了豬肉樣中克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林和西馬特羅5種藥物同時分析的LC-MS/MS 分析方法。該方法具有簡單、準確和靈敏的特點，能夠滿足藥物殘留分析要求，此方法也可被推廣應用到其他動物性產品的受體激動劑檢測中。

4 參考文獻

[1] 張錦紅，江濤，曾昭智，等.HPLC法測定豬血漿及組織中鹽酸克侖特羅的含量[J].廣東藥學院學報，2011，27（3）：239-242.

[2] 王培龍，范理，蘇曉鷗，等.分子印跡固相萃取-氣相色譜-質譜法測定豬尿中4種β-受體激動劑[J].分析化學，2012，40（3）：470-473.

[3] 蔣萬楓，董詩竹，李鈺.氣相色譜-串聯質譜法測定動物組織中6種β-受體激動劑殘留量研究[J].現代農業科技，2012（3）：33-34.

[4] 朱堅，李波，方曉明，等.氣相色譜-質譜法測定肝、腎和肉中11種β-受體激動劑殘留量[J].質譜學報，2005，26（3）：129-134.

[5] 歐貝麗，倪偉華，鄒燕，等.超高效液相串聯質譜法分析豬肉中殘留的15中β-受體激動劑[J].現代農業科技，2015（12）：276-278.

[6] 李瑩瑩，宋永青，郭文萍，等.超高效液相色譜-串聯質譜方法同時測

定豬肉中7種β-受體激動劑殘留量[J].肉類研究，2012，26（5）：25-

29.

[7] 侯建波，謝文，陳笑梅，等.液相色譜-串聯質譜-同位素稀釋法同時測定豬肉中54種藥物殘留[J].質譜學報，2012，33（1）：42-53.

[8] 劉敏，劉戎，王立琦，等.豬肝中β-受體激動劑多殘留的樣品前處理方法比較及同時檢測[J].分析測試學報，2012，31（3）：290-295.

[9] 羅輝泰，黃曉蘭，吳慧勤，等.分散固相萃取-同位素稀釋-高效液相色譜-串聯質譜法同時測定豬肉中26種β-受體激動劑[J].色譜，2016，34（5）：481-489.

[10] 張學亮，羅云敬，姜潔，等.分析印跡固相萃取-超搞效液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中5種β2-受體激動劑殘留[J].色譜，2015，33（8）：838-842.

[11] 孫海新，凌紅麗，高亞東，等.肉品中萊克多巴胺殘留的酶聯免疫快速檢測方法的建立[J].畜牧與獸醫，2010，42（6）：71-75.

[12] 孫海新，凌紅麗，王雷，等.沙丁胺醇殘留的酶聯免疫檢測方法的建立[J].中國動物檢疫，2009，26（12）：44-47.