五福飲口服液的提取工藝研究

劉效栓，李喜香，李季文，畢映燕，錢夢茹

甘肅省中醫院藥學部，甘肅 蘭州 730050

五福飲口服液原方出自張仲景《景岳全書·新方八陣》卷五十一方之五福飲，由人參、當歸、熟地黃、炒白術、炙甘草等5味藥物組成，主治五臟氣血虧損，在防治人類亞健康方面有較大開發前景。本研究擬將傳統五福飲湯劑制備成五福飲口服液，通過單因素試驗及中心組合設計-效應面法對五福飲口服液的提取工藝進行優化，選取最佳提取工藝參數，為防治亞健康的五福飲口服液保健品開發提供依據。

1 材料

1.1 儀器 UV1800型紫外-可見分光光度儀（SHIMADZU）；旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；電子天平AR522CN、AR124CN（上海奧豪斯儀器有限公司）；鼓風式干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 試藥 人參、當歸、熟地黃、炒白術、炙甘草飲片（甘肅省中醫院藥學部提供）；人參皂苷Re（中國食品藥品檢定研究院，批號：20140901）；D-無水葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院，批號：20140715）；95%乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇（天津富宇精細化工有限公司）；無水乙醇、濃硫酸、冰乙酸、高氯酸（天津百世化工有限公司）；試驗用水為自制蒸餾水。

2 方法與結果

按處方量（人參12.0 g，當歸18.0 g，熟地黃18.0 g，炒白術 9.0 g，炙甘草 6.0 g）稱取藥材，以浸泡時間、料液比、提取時間、提取次數為考察因素，加水回流提取，過濾，收集合并濾液，將濾液濃縮至一定量，測定干膏得率、總多糖含量、總皂苷含量。

2.1 干膏得率測定方法 取蒸發皿干燥恒重，將10 mL濃縮液轉移至蒸發皿，于烘箱（105℃）中烘3小時后取出，轉移至干燥器中，放置恒溫，稱重［1-4］。干膏得率（g/g）=（10 mL 濃縮藥液干燥后所得干膏量×10）/63。

2.2 總多糖含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 稱取D-無水葡萄糖適量，精密稱定，配制成每毫升含0.100 0 mg溶液，精密量取50 μL該溶液至50 mL容量瓶，加水稀釋至刻度，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 量取濃縮藥液10 mL，加入95%乙醇溶液，使體系含醇量達到60%，置于-4℃冰箱內，冷藏醇沉，24小時后取出抽濾，烘干。將全部沉淀溶解至25 mL容量瓶中，加水至刻度，定容搖勻，備用。量取上述溶液0.1 mL，稀釋至10 mL，即為供試品溶液。

2.2.3 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液 200、400、600、800、1 000 μL 于 6 支干燥具塞試管中，不足1 mL者加蒸餾水補足1 mL，依次加入6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴15分鐘后取出立即放入冰水浴10分鐘后取出，室溫放置15分鐘，照中國藥典Ⅰ部附錄V A紫外-可見分光光度法，于485 nm處測定吸光度（A）值，以A值為縱坐標，質量濃度為橫坐標進行線性回歸，并繪制標準曲線，所得回歸方程：

2.2.4 方法學考察 考察該方法的精密度、穩定性、重復性、加樣回收率，其RSD分別為1.50%、1.78%、0.95%、1.13%，說明方法可行。

2.2.5 樣品的測定 量取供試品溶液1.0 mL，加入6%苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，搖勻，沸水浴15分鐘，冰水浴10分鐘，室溫放置15分鐘，于485 nm處測定吸光度（A）值。將吸光度（A）值代入回歸方程計算得樣品中總多糖含量［5-8］。

2.3 總皂苷含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 稱取人參皂苷Re適量，精密稱定，配制成每毫升含0.004 0 mg溶液，備用。

2.3.2 供試品溶液的制備 量取5 mL濃縮藥液，加入無水乙醚萃取3次，20 mL/次，棄乙醚層，水層加水飽和的正丁醇萃取3次，30 mL/次，合并正丁醇層，并以適量濃氨水將正丁醇層洗滌2次，將洗滌后的正丁醇層溶液轉移至旋轉蒸發儀，蒸干溶劑，殘渣加甲醇溶解，定容至10 mL，搖勻，即得供試品溶液。

2.3.3 標準曲線的繪制 精密吸取 50、100、200、300、400、500 μL人參皂苷Re對照品溶液（濃度為0.0040 mg/mL）分別置于6支干燥具塞試管中，揮干溶劑后加入0.5 mL 0.2%香草醛-高氯酸溶液，混合均勻后，置于60℃恒溫水浴15分鐘，取出立即用冰水冷卻2分鐘，加入77%硫酸溶液5 mL，取出放置至室溫，消除汽泡后照紫外可見分光光度法，于535 nm處測定吸光度，并以吸光度（A）為縱坐標，質量濃度為橫坐標進行線性回歸，并繪制標準曲線，回歸方程為Y=0.001X+0.115（R=0.999）。

2.3.4 方法學考察 考察該方法的精密度、穩定性、重復性、加樣回收率，其 RSD 分別為 1.25%、1.39%、1.90%、1.26%，說明方法可行。

2.3.5 樣品的測定 精密吸取樣品溶液100μL，置于100mL具塞試管中，后續處理方法與繪制標準曲線時操作相同，照中國藥典Ⅰ部附錄VA紫外-可見分光光度法，于535 nm處測定吸光度（A）值。將吸光度（A）值代入回歸方程計算得樣品中總皂苷含量［9-12］。

2.4 提取工藝的單因素試驗 根據文獻［13］、［14］、［15］確定浸泡時間、提取時間、提取次數、加水量為五福飲口服液提取工藝的影響因素。本試驗按處方量（人參12.0 g，當歸18.0 g，熟地黃18.0g，炒白術9 g，炙甘草6.0 g）稱取藥材，以浸泡時間、料液比、提取時間、提取時間次數為考察因素，加水回流提取，過濾，收集合并濾液，將濾液濃縮至一定量，測定干膏得率、總多糖含量、總皂苷含量。從而初步確定各因素水平。

2.4.1 浸泡時間 按處方量稱取藥材4份，分別加入630 mL水（10 倍），置于圓底燒瓶中，分別浸泡 0、15、30、60 分鐘，回流提取1小時，過濾，收集濾液，濾液濃縮至 100 mL。按照“2.1”“2.2”“2.3”項下操作方法測定干膏得率、總多糖、總皂苷含量。結果可見，隨著浸泡時間的延長，各指標含量呈上升趨勢，浸泡至60分鐘含量最高，但與30分鐘時含量相差較小，綜合考慮時間成本與各指標成分的提取量，確定浸泡時間為30分鐘，見表1。

表1 不同浸泡時間各指標含量測定結果

2.4.2 提取時間 稱取處方量藥材4份，編號1-4，置于圓底燒瓶中，分別加入630 mL水（10倍），浸泡30分鐘后，1-4號分別回流提取0.5，1，2，3小時，過濾，收集濾液，濾液濃縮至100 mL。分別按照“2.1”“2.2”“2.3”項下操作方法測定干膏、總多糖、總皂苷含量，結果可知，提取1、2、3小時的各指標含量較提取0.5小時含量高，但互相之間差異不大，因此提取時間需由進一步的試驗來確定，見表2。

表2 不同提取時間各指標含量測定結果

2.4.3 提取次數 稱取處方量藥材1份，編號1-4，每份含人參 12.0g，熟地黃 18.0g，當歸 18.0g，炒白術9.0 g，炙甘草6.0 g，置于圓底燒瓶中，浸泡30分鐘后，回濾液流提取，每次所得濾液單獨收集，第1次提取結束，過濾后加入630 mL水（10倍）提取第2次，以此類推，共提取4次，過濾，分別收集每次濾液，均濃縮至100 mL。分別按照“2.1”“2.2”“2.3”項下操作方法測定干膏、總多糖、總皂苷含量，結果可知，第4次提取所得干膏得率、總多糖含量、總皂苷含量僅占4次總量的2.58%，5.56%，2.71%，可知經 2 次提取后，各指標含量提取量在90%以上，可認為已提取完全，故將提取次數確定為2次，見表3。

表3 不同提取次數各指標含量測定結果

2.4.4 加水量 稱取處方量藥材4份，置于圓底燒瓶中，分別加入相當于藥材重（61 g）8、10、12、14倍的水，煎煮3次，2 h/次。合并煎煮液，濃縮至 100 mL。分別按照“2.1”“2.2”“2.3”項下操作方法測定干膏、總多糖、總皂苷含量。結果可知，在加水量的試驗中，除8倍溶劑所得干膏、總多糖、總皂苷的含量較低外，其余10、12、14倍溶劑評價指標含量相差不大，需由進一步試驗確定，見表4。

表4 不同加水量各指標含量測定結果

2.5 提取工藝的優化

2.5.1 中心組合設計-響應面法試驗設計 由以上數據及圖表分析，確定試驗浸泡時間為30分鐘、提取次數為2次，并選定各影響因素的水平。由于單因素試驗研究難以反映多個因素之間相互作用對提取工藝的影響，因此需要結合中心組合設計-響應面試驗對提取時間、加水量進行進一步考察，再根據中心組合設計得出的結果綜合分析確定。故研究擬采用中心組合設計-響應面法優化提取工藝［16-18］，以干膏得率、總多糖含量、總皂苷含量的綜合評分為指標，考察提取時間、加水量等因素，因素水平見表5。

表5 五福飲口服液提取工藝因素-水平

2.5.2 中心組合設計-響應面試驗結果 按照“2.5.1”項下方法對提取工藝進行優化，結果見表6。以Design-Expert 8.05 b軟件分析，所得方差分析結果見表7，響應面結果見圖1—2。

表6 中心組合設計-響應面試驗結果

表7 中心組合設計-響應面試驗回歸方程方差分析

圖1 提取時間和料液比對綜合評分的等高線

圖2 提取時間和料液比對綜合評分的響應面

由表7可以看出，該模型失擬項顯著（P＜0.05），決定系數（P＞0.05）不顯著，證明該模型擬合度和可信度較好。另外，因素A、A2、B2對統計結果影響顯著，因素B和交互項AB影響不顯著，說明該模型可用于五福飲口服液提取工藝的優化。

利用響應面和等高線分析各因素的相互作用，等高線密度大說明影響因素對響應值貢獻大。并且等高線的形狀可直觀看出交互效應的大小，橢圓形反映了兩因素交互作用較強，呈圓形則相反，而響應曲線較陡說明交互作用較強。從圖1可看出等高線呈橢圓形，說明影響因素提取時間（A）與料液比（B）交互作用較明顯。響應面圖可知該模型有穩定點，且穩定點是最大值。

利用Point Prediction進行預測分析，獲得一組響應值最大的優化條件：提取時間A為136.3分鐘，料液比為10.79，在此優化條件下，R為0.831。根據得到的最優條件，并且考慮到實際操作的可行性，將五福飲口服液的提取條件在回歸方程得到的理論值基礎上修正為：浸泡30分鐘，提取2次，提取時間A為120分鐘，料液比B為11倍，在此條件下提取，依法計算綜合評分值，對預測結果進行3批驗證，綜合評分結果為0.828（n=3）。預測值與實際值之間偏差較小，說明二次多項式數學模型所得到的優化條件符合設計目標，試驗設計和數學模型可靠且重現性良好。

2.6 提取工藝驗證試驗 根據中心組合設計-響應面法的預測結果，同法做3批驗證試驗，結果表明，綜合評分的平均值為0.828，實際值與預測值較為接近，該方法可用于五福飲口服液的提取，見表8。

表8 提取工藝驗證試驗結果

3 討論

中心組合設計-響應面優化法是將中心組合設計試驗得出的數據結果進行響應面分析后，描繪出響應-考察因素曲面圖，預測模型一般是一個連續的曲面。從響應曲面上選擇最優的響應區，確定自變量的取值范圍，即可確定最佳試驗條件，其優勢是在試驗條件尋優過程中，可以連續地對試驗自變量的各個水平進行分析［19］。該方法所采用的模型為非線性數學模型，在中心點進行重復性試驗，以此提高試驗精度，試驗次數少、預測性良好、可信度較高。

本試驗研究了五福飲口服液的提取工藝，通過單因素試驗選取2個影響因素，建立影響因素與響應值（干膏得率、總多糖含量、總皂苷含量三者的綜合評分為響應值）相互作用的數學模型，繪制響應曲面圖，通過建立目標函數的二次回歸方程，預測最佳提取工藝，試驗結果與函數預測值一致。