肺抑瘤合劑質量標準研究*

隋曉麗，張紅艷，田曉倩 ，彭召云，李 芳，劉 健，鄭 心△

1山東中醫藥大學第二附屬醫院，山東 濟南 250001；2山東中醫藥大學

肺抑瘤合劑是山東中醫藥大學第二附屬醫院自主研發的口服中藥合劑，由黨參、黃芪、白花蛇舌草、半枝蓮、薏苡仁、浙貝母、夏枯草、甘草等12味中藥組成，具有益氣養陰，清熱解毒，化痰祛瘀的功效。臨床主要用于原發性支氣管肺癌氣陰兩虛、痰瘀熱毒互結證，癥見咳嗽、咳痰或咳痰帶血、胸痛、憋喘、發熱、乏力、納呆等癥狀。根據《醫療機構制劑注冊管理辦法》相關要求，為有效控制該制劑的質量，保證臨床療效的穩定性，本研究采用薄層色譜法（TLC）對方中黃芪、薏苡仁、浙貝母、甘草4味藥進行定性鑒別。黃芪是方中君藥，黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分之一，黃芪及制劑中多以黃芪甲苷作為質量控制指標，本研究參考有關文獻［1-4］，采用高效液相色譜-蒸發光散射檢測（HPLC-ELSD）法測定肺抑瘤合劑中黃芪甲苷的含量，建立專屬性強、穩定可靠的質量控制方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜色譜儀（美國Agilent公司）；Agilent 380-ELSD蒸發光散射檢測器（美國Agilent公司）；AB135-S型電子天平（METTLER TOLEDO）；KQ-500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑 黃芪甲苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110781-201314）；薏苡仁油對照提取物（中國食品藥品檢定研究院，批號：111750-201102）；薏苡仁對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121254-201203）；貝母素甲對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110750-201311）；貝母素乙對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110751-201110）；浙貝母對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：120972-200404）；甘草苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：13020901）；甘草對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：120904-201318）。乙腈為色譜純；水為哇哈哈高純水，其他試劑均為分析純。肺抑瘤合劑樣品及陰性樣品（山東中醫藥大學第二附屬醫院制劑室自制，批號：20150511，20150513，20150518）。

2 方法與結果

2.1 黃芪的鑒別 取黃芪對照藥材2 g，加甲醇20 mL，超聲30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，制成對照藥材溶液。再取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按照TLC法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液和陰性對照溶液各20 μL、對照藥材溶液10 μL與對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷 - 甲醇 - 水（13∶7∶2）的下層為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光及紫外光（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中在與對照藥材色譜和對照品色譜相應位置上日光下顯相同顏色的斑點，紫外光下顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾，見圖1。

圖1 黃芪TLC鑒別

2.2 薏苡仁的鑒別 取本品30 mL，取石油醚（60～90℃）30 mL，超聲處理 30 分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加石油醚（60～90℃）1 mL使之溶解，作為供試品溶液。取處方中除去薏苡仁藥材的其余藥材，同法制成缺薏苡仁的陰性對照溶液。另取薏苡仁對照藥材 1 g，加石油醚（60～90℃）30 mL，超聲處理30分鐘，濾過，取濾液，作為對照藥材溶液。再取薏苡仁油對照提取物，作為對照提取物溶液。依照TLC法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液和陰性對照溶液各20 μL、對照藥材溶液5 μL與對照提取物溶液1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙醚 - 冰醋酸（83∶17∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。結果供試品色譜中在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖2。

圖2 薏苡仁TLC鑒別

2.3 浙貝母的鑒別 取本品25 mL，加濃氨試液5 mL與三氯甲烷25 mL，超聲30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。取處方中除去浙貝母藥材的其余藥材，同法制成缺浙貝母的陰性對照溶液。另取浙貝母對照藥材1g，加濃氨試液2 mL與三氯甲烷25 mL，超聲30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。再取貝母素甲對照品、貝母素乙對照品，加三氯甲烷制成每1 mL各含2 mg的混合溶液，作為對照品溶液。按照TLC法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液和陰性對照溶液各20 μL、對照藥材溶液15 μL與對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯 - 甲醇 - 濃氨試液（17∶2∶1）為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。結果供試品色譜中在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。見圖3。

2.4 甘草的鑒別 取本品25 mL，加乙醚提取2次，30 mL/次，棄去乙醚液，用正丁醇提取3次，20 mL/次，合并正丁醇液，用水洗滌3次，20 mL/次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。按處方另取去除甘草以外的藥材同法制成陰性液。另取甘草對照藥材l g，加乙醚40 mL，加熱回流1小時，濾過，棄去醚液，藥渣加甲醇30 mL，加熱回流1小時，濾過，濾液蒸干，殘渣加水40 mL使溶解，自“用正丁醇提取3次”起，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。再取甘草苷對照品，加甲醇制成每l mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。按照TLC法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗，吸取上述4種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷 - 甲醇 - 水（13∶7∶2）的下層為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光及紫外光（365 nm）下檢視。結果供試品色譜中在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，日光下顯相同顏色斑點，紫外光下顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾，見圖4。

圖3 浙貝母TLC鑒別

圖4 甘草TLC鑒別

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈 - 水（32∶68），流速1.0 mL/min，柱溫25℃，ELSD參數：漂移管溫度90℃，霧化溫度40℃，載氣流速為1.20 L/min。理論塔板數按黃芪甲苷計算不低于4 000。

2.5.2 供試品溶液的制備 取肺抑瘤合劑樣品（批號：20150511），搖勻，精密量取 20 mL，用水飽和正丁醇振搖提取4次，40 mL/次，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，40 mL/次，棄去氨液，正丁醇液水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.5.3 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.458 0 mg的溶液，即得。

2.5.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例，不加黃芪藥材，按本品制備工藝制得缺黃芪陰性樣品，再按“2.5.3”項下方法制備缺黃芪的陰性對照溶液。2.5.5 專屬性試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，供試品溶液和陰性對照溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結果對照品和供試品有相同保留時間的色譜峰，陰性對照在此保留時間無色譜峰，表明在該色譜條件下陰性對照溶液對黃芪甲苷含量測定無干擾，見圖5—7。

圖5 黃芪甲苷對照品

圖6 肺抑瘤合劑樣品

圖7 陰性對照樣品

2.5.6 線性關系考察 取黃芪甲苷對照品溶液（0.4580 mg/mL），按“2.5.1”項下色譜條件，分別進樣 2，4，8，10，15，20 μL，測得峰面積，計算進樣量和峰面積的對數，繪制回歸方程。回歸方程：lgY=1.418lgX+2.480，r=0.999 5，結果表明，黃芪甲苷進樣量在0.916 0～9.160 0 μg范圍內線性關系良好。

2.5.7 精密度試驗 取黃芪甲苷對照品溶液（0.422 0 mg/mL），按“2.5.1”項下色譜條件，進樣10 μL，連續進樣6次，測得峰面積值，結果峰面積RSD為1.97%，表明儀器精密度良好。

2.5.8 重復性試驗 取肺抑瘤合劑樣品（批號：20150511），搖勻，精密量取 20 mL，稱取 6 份，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，結果其含量平均值為21.74 μg/mL，RSD為1.47%，表明該方法重復性良好。

2.5.9 穩定性試驗 取肺抑瘤合劑樣品（批號：20150511），搖勻，精密量取 20 mL，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，分別于放置后的0，2，4，8，12，16小時測定。結果表明供試品溶液在16小時內基本穩定，黃芪甲苷峰面積RSD為1.90%。

2.5.10 加樣回收率試驗 取肺抑瘤合劑樣品（批號：20150511，黃芪甲苷含量 21.74 μg/mL），搖勻，精密量取20 mL，稱取6份，分別精密加入黃芪甲苷對照品水溶液（0.549 8 mg/mL）1 mL，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，測定，計算得加樣平均回收率為96.99%，RSD為0.96%。

2.5.11 黃芪甲苷含量測定 取3批肺抑瘤合劑，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，測定，結果見表 1。

表1 3批樣品中黃芪甲苷的含量

3 討論

3.1 TLC鑒別 本研究對肺抑瘤合劑中黃芪、薏苡仁、浙貝母、甘草4味藥材的TLC鑒別條件進行考察和優化。參照《中國藥典》（2015年版）［5］，在薄層鑒別中，黃芪測定的是黃芪甲苷和黃芪對照藥材，薏苡仁測定的是薏苡仁油對照提取物，浙貝母測定的是貝母素甲、貝母素乙，甘草測定的是甘草酸單銨鹽和甘草對照藥材，上述4味藥材有明確的測定成分，因此在選用對應的對照品溶液的基礎上同時選用對照藥材。

在參照《中國藥典》2015年版鑒別方法的基礎上，經過試驗與調整，確定黃芪、薏苡仁和浙貝母的鑒別方法。甘草選用的是甘草苷對照品，并對其展開系統進行考察，結果采用乙酸乙酯-甲酸- 冰醋酸 - 水（15∶1∶1∶2）為展開劑；考察了10 cm 和20 cm的薄層板，供試品斑點的分離度均不好。采用三氯甲烷 - 甲醇 - 水（13∶7∶2）的下層為展開劑，供試品斑點清晰、分離度好。最終確定以三氯甲烷- 甲醇 - 水（13∶7∶2）的下層為展開劑。

3.2 含量測定

3.2.1 指標成分的選擇 本制劑由黨參、黃芪等12味藥材經提取、濃縮、加工成液體制劑。黃芪為方中君藥，其所含的成分主要為黃芪甲苷等皂苷類成分及毛蕊異黃酮等黃酮類成分，黃芪甲苷含量高、性質穩定，且文獻中應用黃芪甲苷作為黃芪藥材含量測定成分的報道居多，方中白花蛇舌草等含有大量黃酮類成分，導致毛蕊異黃酮干擾嚴重，雜質較多，且毛蕊異黃酮對照品較難獲得，故本研究用高效液相法定量樣品中的黃芪甲苷含量。

3.2.2 測定方法的選擇 由于黃芪甲苷在紫外區為末端吸收，信號較弱，其他雜質干擾大，很難達到基線分離［6］，蒸發光散射檢測器為通用型檢測器，對皂苷類等紫外末端吸收的物質響應較好。因此本研究選擇HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷。

3.2.3 流動相的選擇 曾采用A乙腈-水（35∶65）、B 乙腈 - 水（25∶75）、C 乙腈 - 水（32∶68）作為流動相，考察出峰時間和色譜分離情況，結果流動相A出峰時間過早，譜圖出現雜質峰較多，樣品中的其他成分對黃芪甲苷峰的干擾明顯；流動相B出峰時間過晚，超過20分鐘，分析時間長，溶劑用量大；而流動相C的出峰時間為16分鐘左右，各成分分離情況較好，所測得黃芪甲苷峰形良好。綜合考慮選擇乙腈-水（32∶68）作為本研究的流動相。

3.2.4 ELSD檢測器參數的考察 本研究對漂移管溫度、霧化溫度和載氣流速進行考察，結果漂移管溫度90℃，霧化器溫度40℃時，黃芪甲苷有較低的信噪比和較高的信號響應值，可獲得最大的檢測靈敏度，且載氣流速對峰保留時間、峰形均有一定影響，流速越大，響應值越小，綜合各因素，經多次試驗，確定了漂移管溫度為90℃，霧化器溫度40℃，載氣流速為1.20 L/min。

綜上所述，所建立的質量控制方法準確可靠，可用于肺抑瘤合劑的質量控制。