HPLC法同時測定甘露消毒丹中3種成分含量*

劉光華 ，于 艷 ，王思源，王貴幫，吳振起，劉 娟

1遼寧中醫藥大學基礎醫學院，遼寧 沈陽 110847；2遼寧中醫藥大學附屬醫院；3遼寧中醫藥大學研究生院

甘露消毒丹方首載于清代醫家魏之琇所著的《續名醫類案》中［1］，由滑石、茵陳、黃芩、連翹等藥物組成，具有利濕化濁，清熱解毒的功效，主治時疫侵體，濕溫互結證，臨床上廣泛應用于多種病證［2-4］，表現為發熱倦怠，或午后身熱，頤腫口渴，嘔惡，咽喉腫痛，肢酸，身目發黃，胸悶腹脹，泄瀉，淋濁，尿短色赤，舌苔淡白或厚膩或干黃，脈濡數或滑數。甘露消毒丹為治療濕熱并重，毒邪蘊藉，肆逆氣分的主要方劑，辨證屬濕熱毒蘊郁不解者，療效顯著。目前甘露消毒丹的提取尚缺乏質量控制方面的研究，而HPLC是化學科學中最有優勢的儀器分析方法之一，尤其在有機、高分子化合物結構的確定方面具有優勢［5］。故本實驗采用 HPLC［6-8］波長切換法同時測定甘露消毒丹中綠原酸、黃芩苷、連翹苷3種成分含量［9-11］，為甘露消毒丹的質量控制提供一定的實驗依據，同時為新藥開發和臨床應用提供科學基礎。

1 儀器與材料

HH-4型恒溫數顯水浴鍋（常州國華電器有限公司）；AR2140型電子天平（上海奧豪斯公司）；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；RE-52A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；美國Agilent 1100高效液相色譜儀；G1379A真空脫氣機；G1311A四元梯度泵；G1313A自動進樣器；G1315A柱恒溫箱；G1315B二極管陣列檢測器；Agilent B04.03化學工作站；AE-240電子分析天平；KH-400DB型數控超聲波清洗器。中藥飲片購自遼寧中醫藥大學附屬醫院中藥房，經遼寧中醫藥大學中藥分析教研室鑒定均為正品；黃芩苷對照品（批號：110715-200514）、綠原酸對照品（批號：110753-200413）均購自中國藥品生物制品檢定所，連翹苷對照品（批號：16041519）購自北京世紀奧科生物技術有限公司，含量均大于98%。乙腈為色譜純（美國Fisher公司）；水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司），其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18（4.6mm×250 mm，5 μm）色譜柱；檢測波長0～20分鐘為327nm；20分鐘以后為230nm。柱溫30℃；流速1.0mL/min。流動相：乙腈為流動相A，0.1%磷酸水溶液為流動相B，按表1進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

在上述色譜條件下，理論板數按綠原酸峰計算應不低于3 000，分離度＞1.5，混合對照品與供試品色譜圖，見圖1。

圖1 混合對照品與供試品色譜圖

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷、綠原酸、連翹苷對照品適量，置同一量瓶中，加甲醇制成每 1 mL 含黃芩苷 39.8 μg、綠原酸 77.6 μg、連翹苷60.4 μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 甘露消毒丹（滑石、茵陳、黃芩、石菖蒲、白豆蔻、藿香、木通、射干、川貝母、連翹、薄荷等11味中藥飲片）經70%乙醇提取，回收溶劑，減壓濃縮，進一步干燥得甘露消毒丹干粉。取本品粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，加甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 測定方法 分別精密吸取對照品溶液10 μL與供試品溶液5 μL，注入高效液相色譜儀，測定，用外標一點法計算各成分的含量，即得。

2.5 線性范圍考察 分別精密吸取混合對照品溶液 1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜峰面積。進樣量X（μg）與色譜峰面積Y經線性回歸，得回歸方程為：

綠原酸在 0.079 1～1.977 5 μg，黃芩苷在0.382 7～9.567 5 μg，連翹苷在 0.0652～1.6300μg范圍內線性關系良好。

2.6 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液5 μL，注入高效液相色譜儀，連續進樣6次，結果表明峰面積值的RSD分別為黃芩苷0.95%、綠原酸0.86%、連翹苷1.05%，表明本方法精密度良好（n=6）。

2.7 重復性試驗 取供試品（70%乙醇提取）細粉6份，分別制備成供試品溶液，按樣品含量測定方法測定，結果顯示綠原酸、黃芩苷、連翹苷的平均含量分別為 0.536、4.099、0.364 mg/g，RSD 分別為綠原酸2.79%、黃芩苷3.57%、連翹苷2.10%，表明本方法重復性良好（n=6）。

2.8 穩定性試驗 取供試品（70%乙醇提取）溶液，分別在 0、2、4、6、8、12 小時測定峰面積，結果表明峰面積RSD分別為黃芩苷2.73%、綠原酸1.11%、連翹苷1.47%，表明本品溶液12小時內穩定性良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品0.25 g，共計6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對照品溶液（含綠原酸0.260 mg/mL，黃芩苷 2.095 mg/mL，連翹苷 0.170 mg/mL）2.0 mL，蒸干溶劑，按供試品溶液制備方法制備，進行含量測定，計算回收率，結果見表2。

表2 回收率試驗結果（n=6）

2.10 樣品含量測定 取樣品，精密稱定，按上述方法制備成供試品溶液，再按本文選定的色譜條件測定峰面積，用外標法計算樣品中3種成分的含量，結果見表3。

表3 樣品中黃芩苷、綠原酸與連翹苷的含量測定 m g/g

3 討論

甘露消毒丹以滑石、茵陳、黃芩為君藥，其中滑石通水利淋，清暑解熱；茵陳清利濕熱，退黃；黃芩清熱燥濕、瀉火解毒；三藥共奏利濕化濁、清熱滲濕之效。以石菖蒲、白豆蔻、藿香為臣藥，其中石菖蒲化濕和胃，滌痰辟穢；白豆蔻化濕行氣，溫中止嘔；藿香芳香化濕，辟穢和中止嘔；三藥均辛溫，宣泄氣機，芳香化濕，于熱從治，于濕正治，齊做臣藥，尤宜于濕遏中焦之證。藿香、茵陳同用芳化清利、醒脾助運、清熱化濁。余藥為佐藥，其中木通清利通淋，泄熱，又助滑石、茵陳給濕熱以出途；射干清熱解毒，祛痰利咽；貝母化痰止咳，清熱散結，配射干增強清肺利咽之功；連翹清熱解毒，消癰散結，其輕浮可透達內外，攜黃芩可強化彼此之效；薄荷疏散風熱，清利頭目，利咽為用；上五藥共為佐藥，彼此配伍尤能利咽化痰，開解散毒，暢達氣機，通利水濕。諸藥聯用，以君三臣三佐五為制，具宣清降利之用，以利濕化濁，清熱解毒為治［12］。目前研究［13-15］表明黃芩苷為黃芩發揮功效作用的主要指標性成分，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、解熱、鎮痛、清除氧自由基等多種作用；綠原酸為茵陳的主要作用成分，具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗內毒素、保肝等作用［16-18］；連翹苷為連翹的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗感染、解熱、抗氧化等作用［19-21］。

本試驗建立了HPLC法以測定甘露消毒丹中3種成分含量，即綠原酸、黃芩苷和連翹苷，檢測過程采用波長切換方法，其中色譜圖中顯示綠原酸的最大吸收波長為327 nm，而連翹苷的最大吸收波長為228 nm處，黃芩苷的最大吸收波長為278 nm，由于黃芩苷和連翹苷均在230 nm處吸收峰峰形較佳，且分離度符合要求，為使操作簡便、快速、易行，綠原酸在327 nm處進行檢測，黃芩苷和連翹苷則將波長切換至230 nm處進行檢測。試驗中對供試品提取條件進行了考察，分別采用水，30%、50%、70%、90%乙醇作為提取溶劑，計算其提取效率。結果顯示，采用70%乙醇作為提取溶劑可較好去除干擾雜質，所得綠原酸、黃芩苷和連翹苷含量較大，提取較完全，效果最佳。本試驗曾比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水流動相系統，比較各組分的保留時間與分離度，經反復嘗試與摸索，結果乙腈-0.1%磷酸水的分離效果好，且穩定性、峰形均較好，拖尾因子及分離度均符合要求，且出峰時間適宜。故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液作為本試驗的流動相。本試驗建立了HPLC法測定甘露消毒丹中綠原酸、黃芩苷和連翹苷的具體含量，平均含量分別為2.389、28.362和4.354 mg/g，分離效果理想，重現性好，為臨床應用及該方劑的進一步研究提供了試驗依據。