益智仁揮發油對東莨菪堿致小鼠學習記憶障礙的改善作用研究

馬俊俏 吳勇 周俊璇 邱振鵬 張寶徽 胡俊杰 田先翔

摘 要 目的：考察益智仁揮發油對東莨菪堿誘導的小鼠學習記憶障礙的改善作用。方法：將50只雄性小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性藥物組（鹽酸多奈哌齊，3 mg/kg）和益智仁揮發油低、高劑量組（0.5、1 mL/kg），每組10只。除正常組、模型組小鼠灌胃等體積水外，其余組小鼠均灌胃對應藥物，連續27 d；自給藥第22天起，除正常組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水外，其余組小鼠均連續6 d腹腔注射氫溴酸東莨菪堿溶液（3 mg/kg）進行造模。末次給藥結束后，采用Morris水迷宮實驗考察小鼠行為學；采用蘇木精-伊紅染色法觀察小鼠海馬組織CA1區神經細胞形態學；檢測小鼠海馬組織中乙酰膽堿酯酶（AChE）、膽堿乙酰轉移酶（ChAT）的活性；檢測小鼠海馬組織和血清中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性及丙二醛（MDA）的含量。結果：與模型組比較，陽性藥物組和益智仁揮發油高劑量組小鼠的逃避潛伏期分別自第2、3天起顯著縮短，第Ⅲ象限停留時間、第Ⅲ象限路程百分比和穿臺次數均顯著延長或增加，首次穿臺時間均顯著縮短（P<0.05或P<0.01）；小鼠海馬組織CA1區神經細胞排列較整齊，結構相對正常，核濃染的程度降低；小鼠海馬組織中ChAT、SOD、GSH-Px活性和血清中SOD、GSH-Px活性均顯著升高，海馬組織中AChE活性顯著降低，海馬組織和血清中MDA含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。益智仁揮發油低劑量組上述指標雖均有改善，但差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：益智仁揮發油能顯著改善東莨菪堿導致的小鼠學習記憶障礙，其作用機制可能與其調節AChE、ChAT活性來增強膽堿能神經功能及抗氧化損傷有關。

關鍵詞 益智仁；揮發油；東莨菪堿；小鼠；學習記憶障礙；改善作用

中圖分類號 R965；R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）22-3074-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.11

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the improvement effects of volatile oil from the fruit of Alpinia oxyphylla on scopolamine-induced learning and memory impairment in mice. METHODS： 50 male Kunming mice were randomly divided normal group， model group， positive drug group （donepezil hydrochloride， 3 mg/kg） and volatile oil from the fruit of A. oxyphylla low-dose and high-dose groups （0.5， 1 mL/kg）， with 10 mice in each group. Except control group and model group were given equivalent water intragastrically， other groups were given relevant medicine intragastrically for consecutive 27 days. Since the 22nd day of administration， except normal group was given equivalent normal saline， other groups were given Scopolamine hydrobromide solution （3 mg/kg） intraperitoneally for consecutive 6 days. After last medication， Morris water maze test was used to investigate the praxiology of mice. HE staining was used to observe the morphology of neurons in CA1 area of hippocampus in mice. The activities of AChE and ChAT in hippocampus were detected in mice. The activities of SOD and GSH-Px， the content of MDA in hippocampus and serum were also detected. RESULTS： Compared with model group， the escape latencies of mice were shortened significantly in positive drug group and volatile oil from the fruit of A. oxyphylla high-dose group since second and third day， respectively； retention time and distance percentage in the third quadrant， the frequency of crossing platform were prolonged or increased significantly， while the time of initial crossing platform was shortened significantly （P<0.05 or P<0.01）. The neurons in the CA1 area of the hippocampus were arranged orderly， with regular cell shape； the degree of nuclear hyperchromasia was reduced. The activities of ChAT， SOD and GSH-Px in hippocampus， the activities of SOD and GSH-Px in serum were increased significantly； the activity of AChE in hippocampus was decreased significantly； while MDA contents in hippocampus and serum were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. There was improvement to some extent but without statistical significance in above indexes of volatile oil from the fruit of A. oxyphylla low-dose group （P>0.05）. CONCLUSIONS： The volatile oil from the fruit of A. oxyphylla can ameliorate scopolamine-induced learning and memory impairment by enhancing the function of cholinergic neurons through regulating the activities of AChE and ChAT and resisting oxidation.

KEYWORDS Fruit of Alpinia oxyphylla； Volatile oil； Scopolamine； Mice； Learning and memory impairment； Improvement effect

學習記憶障礙是多種神經系統疾病共同的臨床癥狀，隨著社會人口老齡化，其發生率越來越高。因此，尋找有效的藥物來改善學習記憶障礙已成為神經系統疾病治療的重點之一。益智仁是姜科多年生植物益智（Alpinae oxyphylla Miq.）的干燥成熟果實，具有暖腎固精縮尿、溫脾止瀉攝唾之功效[1]?，F代藥理學研究表明，益智仁具有益智健腦、強心、抗癌、抗衰老、鎮靜、鎮痛等多種藥理作用[2-3]。揮發油是益智仁的主要化學成分，近年來研究發現，益智仁揮發油具有脂溶性高、易透過血腦屏障等優點，能夠對抗神經細胞凋亡[4]；益智仁揮發油中的芳樟醇具有自由基清除作用[5]，圓柚酮具有很好的抗氧化活性[6]。但目前國內外對益智仁揮發油改善學習記憶功能的研究較少，故本研究采用腹腔注射東莨菪堿建立小鼠學習記憶障礙模型，考察益智仁揮發油對其學習記憶功能的影響，為益智仁揮發油的深入研究提供實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

Morris水迷宮（中國醫學科學院藥物研究所）；Allegra 64R型高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；xMark型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；Eclipse E200型光學顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

益智仁藥材[武漢市神草中藥飲片有限責任公司，批號：1702013，經湖北中醫藥大學生藥教研室陳科力教授鑒定為姜科植物益智（A. oxyphylla Miq.）的干燥成熟果實]；氫溴酸東莨菪堿對照品（上海晶純生化科技股份有限公司，批號：F1713061，純度：99.9%）；鹽酸多奈哌齊片[衛材（中國）藥業有限公司，批準文號：國藥準字H20050978，規格：5 mg]；乙酰膽堿酯酶（AChE）、膽堿乙酰轉移酶（ChAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級昆明種小鼠，雄性，體質量18～20 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，動物使用許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。小鼠均適應性喂養1周后進行實驗。

2 方法

2.1 益智仁揮發油的制備

采用水蒸氣蒸餾法提取益智仁揮發油。將干燥益智仁粉碎過80目篩，取粉末13.5 kg，加水108 L浸泡6 h，微沸8 h，得益智仁揮發油82.2 mL（得率為0.6%）。將提取的揮發油密閉儲于棕色瓶中，4 ℃保存，備用。在動物實驗前，以聚山梨酯80（最終比例為0.5%）為乳化劑將益智仁揮發油配成乳劑，臨用時按給藥劑量加水稀釋至適當濃度。

2.2 分組、給藥及造模

取50只小鼠，按隨機數字表法分為正常組、模型組、陽性藥物組（3 mg/kg）[7]和益智仁揮發油低、高劑量組（0.5、1 mL/kg，按揮發油計，劑量由預實驗確定），每組10只。陽性藥物組小鼠灌胃鹽酸多奈哌齊溶液（將鹽酸多奈哌齊片碾碎后以水配制成溶液）；益智仁揮發油低、高劑量組小鼠灌胃“2.1”項下稀釋后的乳劑；正常組和模型組小鼠均灌胃等體積水。灌胃體積均為10 mL/kg，每日給藥1次，連續給藥27 d。

參照文獻[8]方法建立小鼠學習記憶障礙模型。自給藥第22天起，在給藥后30 min，除正常組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水外，其余組小鼠均腹腔注射東莨菪堿溶液（生理鹽水配制，劑量為3 mg/kg，給藥體積為10 mL/kg），連續注射6 d。

2.3 小鼠行為學考察

在小鼠末次腹腔注射東莨菪堿或生理鹽水后30 min，采用Morris水迷宮實驗考察其行為學。迷宮中水深25 cm（高出平臺1 cm），水溫為（25±0.5）℃，黑色圓形平臺置于第Ⅲ象限中央。小鼠入水位置為第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ中任意一個象限，入水點均為該象限的中點。每只小鼠每天訓練3次，每次訓練90 s，連續5 d。若小鼠在90 s內找到平臺，則使其在平臺上停留10 s，并記錄小鼠從入水到找到平臺所需的時間，作為逃避潛伏期；若小鼠在90 s內未找到平臺，則由操作人員將其引導至平臺，并停留10 s，將其逃避潛伏期記為90 s。第6天進行空間探索實驗：撤掉平臺，小鼠從第Ⅰ象限入水，持續時間90 s，觀察小鼠在第Ⅲ象限的停留時間、第Ⅲ象限路程百分比、首次穿越平臺（簡稱“穿臺”）的時間和穿臺次數，并記錄小鼠游泳軌跡。

2.4 小鼠海馬組織病理學檢查

水迷宮實驗結束后，各組隨機取4只小鼠，水合氯醛麻醉后開胸，暴露心臟，自左心室升主動脈灌注約50 mL生理鹽水，待流出液為無色時，繼以灌注4%多聚甲醛溶液約60 mL至小鼠全身變硬。灌注結束后，剖取小鼠全腦放入4%多聚甲醛溶液中固定，常規脫水、包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察海馬組織CA1區神經細胞的數量、形態及結構。

2.5 小鼠海馬組織中AChE、ChAT活性檢測

水迷宮實驗結束后，各組取剩余的6只小鼠，水合氯醛麻醉后眼眶取血，4 ℃下3 000 r/min離心15 min，取上層血清，-80 ℃保存；快速剖取腦組織，在冰上仔細剝離海馬組織，按1 ∶ 9的比例（m/v，g/mL）加入4 ℃生理鹽水，制成10%腦組織勻漿，4 ℃下3 000 r/min離心15 min，取上清液，-80 ℃保存。取腦組織勻漿上清液，解凍至室溫后按AChE、ChAT檢測試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀分別于412、324 nm波長處測定吸光度（OD）值，計算AChE、ChAT活性。

2.6 小鼠海馬組織和血清中SOD、GSH-Px活性及MDA含量檢測

取“2.5”項下腦組織勻漿上清液和血清，解凍至室溫后按SOD、GSH-Px、MDA檢測試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀分別于450、412、532 nm波長處測定OD值，計算SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

2.7 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。實驗數據以x±s表示，采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 益智仁揮發油對小鼠行為學的影響

3.1.1 逃避潛伏期 與正常組比較，模型組小鼠的逃避潛伏期明顯延長，從第2天起差異均有統計學意義（P<0.01），表明東莨菪堿明顯降低了小鼠的學習記憶能力；與模型組比較，陽性藥物組和益智仁揮發油低、高劑量組小鼠的逃避潛伏期均縮短，其中陽性藥物組和益智仁揮發油高劑量組分別從第2、3天起差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠逃避潛伏期測定結果見表1。

3.1.2 空間探索行為指標 與正常組比較，模型組小鼠的第Ⅲ象限停留時間、第Ⅲ象限路程百分比和穿臺次數均顯著縮短或減少，首次穿臺時間顯著延長，差異均有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥物組和益智仁揮發油低、高劑量組小鼠的第Ⅲ象限停留時間、第Ⅲ象限路程百分比和穿臺次數均延長或增加，首次穿臺時間均縮短，其中陽性藥物組和益智仁揮發油高劑量組差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠空間探索行為指標測定結果見表2。

3.1.3 游泳軌跡 正常組小鼠的游泳軌跡大多數呈直線式；模型組和益智仁揮發油低劑量組小鼠的游泳軌跡則絕大多數呈邊緣式，沒有明確的定位目標，游泳路徑較正常組明顯增長；陽性藥物組和益智仁揮發油高劑量組小鼠的游泳軌跡呈趨向式，在短暫搜索后即可定位并登陸平臺，游泳路徑較模型組明顯縮短。各組小鼠空間探索游泳軌跡見圖1。

3.2 益智仁揮發油對小鼠海馬組織CA1區神經細胞形態學的影響

正常組小鼠海馬組織CA1區神經細胞數量多、排列整齊，細胞形態完整、結構正常，細胞質豐富，細胞核與細胞質界限清晰可見、核仁明顯；與正常組比較，模型組和益智仁揮發油低劑量組小鼠海馬組織CA1區神經細胞數量減少，細胞核濃染、與胞質界限模糊，細胞形態不規則，核仁不明顯；與模型組比較，陽性藥物組和益智仁揮發油高劑量組小鼠海馬組織CA1區神經細胞排列較整齊，結構相對正常，核濃染和固縮的程度降低。這表明高劑量益智仁揮發油可以改善東莨菪堿導致的小鼠海馬組織神經細胞受損。各組小鼠海馬組織CA1區神經細胞形態學顯微圖見圖2。

3.3 益智仁揮發油對小鼠海馬組織中AChE、ChAT活性的影響

與正常組比較，模型組小鼠海馬組織中AChE活性顯著升高，ChAT活性顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥物組和益智仁揮發油低、高劑量組小鼠海馬組織中AChE活性均降低，ChAT活性均升高，其中陽性藥物組和益智仁揮發油高劑量組差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠海馬組織中AChE、ChAT活性檢測結果見表3。

3.4 益智仁揮發油對小鼠海馬組織和血清中SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠海馬組織和血清中SOD、GSH-Px活性均顯著降低，MDA含量均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥物組和益智仁揮發油低、高劑量組小鼠海馬組織和血清中SOD、GSH-Px活性均升高，MDA含量均降低，其中陽性藥物組和益智仁揮發油高劑量組差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠海馬組織和血清中SOD、GSH-Px活性和MDA含量檢測結果見表4。

4 討論

東莨菪堿為M膽堿受體拮抗藥，易透過血腦屏障進入中樞，可逆性地阻斷中樞內M受體，減少乙酰膽堿（Ach）與受體結合，引起膽堿能神經系統功能失調，導致學習記憶功能障礙[9]。本實驗采用東莨菪堿腹腔注射造模后，小鼠的逃避潛伏期、首次穿臺時間、游泳路徑明顯延長或增加，第Ⅲ象限停留時間、第Ⅲ象限路程百分比和穿臺次數均明顯縮短或減少，表明小鼠的學習記憶功能出現障礙，模型建立成功。益智仁揮發油干預后，其高劑量組小鼠上述指標較之模型組均有顯著改善，表明小鼠的學習記憶能力得到明顯提高。

Ach是中樞膽堿能神經系統的一種神經遞質，在海馬相關的學習記憶過程中起重要作用[10]。AChE和ChAT是Ach代謝過程中的兩個關鍵酶：AChE是Ach的分解酶，ChAT則是Ach的合成酶，兩者共同調節腦組織中Ach的含量，其活性高低可以反映藥物對膽堿能神經功能的改善作用[11]。本研究發現，益智仁揮發油干預后，其高劑量組小鼠海馬組織中AChE 活性顯著降低，ChAT活性顯著升高，提示益智仁揮發油可能是通過調節AChE和ChAT的活性來調節膽堿能神經功能，從而發揮改善學習記憶功能的作用。

學習記憶障礙是多種神經系統疾病的共同癥狀。神經組織由于其獨特的結構，更容易受到氧自由基的攻擊，而細胞代謝時會產生大量自由基，易損傷DNA等大分子，加速神經細胞死亡并導致神經退行性疾病[12]。有研究表明，學習記憶障礙患者體內的自由基清除能力或抗氧化能力下降，導致氧應激因子過量，從而對神經細胞產生毒性[13-14]。當機體處于正常生理狀態時，自由基不斷產生的同時不斷地被自身自由基清除系統清除，體內氧化與抗氧化系統保持著動態平衡；當機體出現某些病變時，如中樞膽堿能神經退化，可導致機體抗氧化酶活性不斷下降，使體內氧自由基不能及時被清除，繼而出現自由基異常堆積[13]。SOD是一種廣泛存在于生物體內、維持機體自由基產生和清除動態平衡的重要酶，其可以催化超氧陰離子自由基發生歧化反應生成過氧化氫，較好地抵御氧自由基和其他氧化物對細胞的毒性作用，是體內清除自由基的重要抗氧化酶[14]。GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，其能催化谷胱甘肽變成氧化型谷胱甘肽，使有害的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而起到保護細胞膜結構和功能的作用[15]。MDA是一種重要的脂質過氧化產物，其異常增加與記憶損傷有關[16]。本研究發現，高劑量益智仁揮發油可顯著升高模型小鼠海馬組織和血清中SOD、GSH-Px活性，顯著降低MDA含量，提示益智仁揮發油可能通過抗氧化損傷發揮改善學習記憶功能的作用。

綜上，益智仁揮發油可顯著改善東莨菪堿導致的小鼠學習記憶障礙，其作用機制可能與抑制AChE活性、提高ChAT活性來增強膽堿能神經功能及抗氧化損傷有關。由于益智仁揮發油中的圓柚酮、芳樟醇等成分具有很好的抗氧化作用[5-6]，因此兩者可能是其改善學習記憶作用的有效活性物質，但后續仍需進一步研究證實。

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（收稿日期：2018-05-17 修回日期：2018-09-26）

（編輯：段思怡）