黑籽重樓的生藥學研究

趙興蕊 劉常遜 楊發建 王洪云

中圖分類號 R284.1；R282.71 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）23-3246-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.17

摘 要 目的：對重樓藥材原植物黑籽重樓進行系統的生藥學研究。方法：對黑籽重樓的植物形態、藥材特征、藥材橫切面及粉末進行觀察；以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ為對照品對藥材進行薄層鑒別，采用高效液相色譜法測定黑籽重樓中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量。結果：黑籽重樓的原植物特征包括具有側膜胎座，果開裂，無外種皮，于一側包以深紅色多汁的雞冠狀假種皮；查閱文獻，黑籽重樓與云南重樓、七葉一枝花在藥材性狀上的區別主要表現在表面顏色、形狀、環紋、斷面上，氣味上沒有明顯的差異；黑籽重樓的橫切面結構、粉末特征與云南重樓、七葉一枝花沒有明顯差異；經薄層色譜鑒別，在黑籽重樓根莖中都含有重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ，含量分別為0.117%、0.081%、0.114%、0.204%；重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量為0.516%，與藥典標準（含重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量不得少于0.60%）存在差異。結論：本研究可為黑籽重樓的鑒定及進一步研究提供科學依據。

關鍵詞 黑籽重樓；性狀鑒別；顯微鑒別；理化鑒別；高效液相色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： Conduct a systematic pharmacognostical study on herbs of Paris thibetica Franch. METHODS： The plant morphology of Paris thibetica Franch， characteristics， cross section and powder were all observed. The polyphyllin Ⅰ， Ⅱ， Ⅵ and Ⅶ were used as reference substance for TLC. HPLC method was used to determine the contents of polyphyllin Ⅰ， Ⅱ， Ⅵ and Ⅶ in Paris thibetica Franch. RESULTS： The original plant characteristic of Paris thibetica Franch was the lateral membrane placenta， the fruits were cracked without outer seed coat， a dark red juicy cockatoo aril was wrapped on one side. After literature review， the character differences of Paris polyphylla Smith var. yunnanensis （Franch.） Hand.-Mazz. and Paris polyphylla Smith var. chinensis （Franch.） Hara were mainly manifested in the surface color， shape， ring pattern and cross section， but there was no obvious difference in odor. There was no significant difference in the transverse section structure and powder characteristics of P. polyphylla Smith var. Yunnanensis （Franch.） Hand. Mazz and P. polyphylla Smith var. chinensis （Franch.） Hara. TLC identification showed that polyphyllin Ⅰ， Ⅱ， Ⅵ and Ⅶ were all found in Paris thibetica Franch， the contents were 0.117%， 0.081%， 0.114%， 0.204%， respectively. Total content of polyphyllin Ⅰ， Ⅱ， Ⅵ and Ⅶ was 0.516%， which was different from the standard value of China Pharmacopoeia （total content of them was no less than 0.60%）. CONCLUSIONS： This study can provide scientific basis for the identification and further research of Paris thibetica Franch.

KEYWORDS Paris thibetica Franch； Characteristics identification； Microscopic identification； Physicochemical identification； HPLC

重樓屬植物全世界共有24個種，我國有7種和8變種[1]。重樓始載于《神農本草經》，以其根莖入藥，具有清熱解毒、消腫止痛和熄風定驚之功效[2]，是云南白藥、宮血寧膠囊等多種中成藥的主要組成藥材[3]。現代研究表明，重樓具有抗腫瘤、抗菌、消炎、止血、止渴、鎮靜、鎮痛等藥理作用[4]。2015年版《中國藥典》（一部）收載的重樓屬植物只有云南重樓、七葉一枝花[5]，但藥材需求量大導致供不應求，植物被大量采挖，資源匱乏日益突出[6]，而該屬植物絕大多數種類在不同地區均供藥用[7]。

黑籽重樓（Paris thibetica Franch）是重樓屬多年生草本植物，主要分布于我國的西藏東南部、云南西北部、四川、甘肅南部、貴州以及不丹和錫金[8]。黑籽重樓以根莖入藥，具有清熱解毒、消腫止痛的功效[9]，該種在民間主要作為重樓藥材使用。目前藥材市場上重樓屬藥用植物有毛重樓、南重樓、黑籽重樓等18個重樓屬植物作為藥用植物在利用[10]。文獻報道[11]，黑籽重樓根莖的主要化學成分是甾體皂苷類化合物，與云南重樓和七葉一枝花化學成分類似，并且化學成分中苷元3位連接糖鏈的甾體皂苷類化合物具有良好的抗腫瘤活性，對人肝癌Bel-7402細胞有細胞毒活性，一定程度上證明了黑籽重樓具有作為重樓替代藥材的物質基礎。另外，李青等[12]研究不同產地的13個黑籽重樓樣品中10種重樓皂苷的含量發現，從崇州采集的黑籽重樓樣品，重樓總皂苷含量高于其他產地，且重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量之和與其他產地的樣品比較也相對較高。現筆者對黑籽重樓的根莖部分進行生藥學研究，希望此研究結果能有利于加強對其的鑒別，也能為合理開發、利用和擴大重樓屬植物的藥用資源提供試驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

BX51顯微鏡（日本Olympus公司）；GoodLook-2000薄層色譜成像系統（上海科哲生化科技有限公司）；Waters2695高效液相色譜儀，包括G1311A四元梯度泵、G1313A自動進樣器、G2170BA色譜工作站、G1314A紫外檢測器（美國Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

試驗藥材于2017年采自于保山地區，樣品編號分別為20170503、20170619、20170706，經楊發建講師鑒定為百合科重樓屬植物黑籽重樓（Paris thibetica Franch）的根莖。重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對照品（批號：分別為CLZI20160517、CLZII20151102、CLZVI20150715、CLVII20161021，純度：≥98%，購于南京春秋生物工程有限公司）；重樓對照藥材（來源于百合科植物云南重樓的根莖，批號：CLYC20160123，購于南京春秋生物工程有限公司）；乙腈為色譜純，水為純化水，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 植物形態鑒別

通過觀察植物器官形態，描述出植物形態。黑籽重樓為多年生草本，莖綠色，有時帶紫色，無毛，高20～47 cm；葉7～12枚或8～12枚，綠色，背稍淡，無毛，線形、線狀長圓形或披針形，先端長漸尖，基部楔形，長6.5～15 cm，寬1～1.6 cm，通常無柄，或具長約僅2～3 mm的短柄。花梗長3.5～11 cm，果期伸長幅度不大，但從基部外折；花基數4～5個或4～7個，遠小于葉數；萼片綠色，線狀披針形、披針形，長3.5～8 cm，寬1～1.8 cm，伸展，平伸或稍下彎；花瓣淡綠色，絲狀，斜伸，比萼片短，長3～5.8 cm；雄蕊2輪，幾乎沒有例外，全長18～49 mm；花絲淡綠色，長5～10 mm；花藥長8～15 mm，藥隔突出部分很長，淡綠色，長8～27 mm；子房長圓錐形，綠色，明顯具棱1 室；側膜胎座4～5個或4～7個，胚珠多數，白色；花柱基紫色，花柱長僅0～1 mm，柱頭綠色，長3～7 mm，星狀平展。果近球形，直徑0.7～1.5 cm，果皮薄，棱翅不明顯，從頂部不規則開裂。種子多數，卵形，長2～3 mm，直徑2～2.5 mm，亮黑色，光滑，堅硬，于一側包以深紅色多汁的雞冠狀假種皮。花期4月，果6月開裂，為開花較早而果成熟最快的一種[13]。黑籽重樓的植物形態見圖1。

2.2 性狀鑒別

觀察自然干燥的根莖，描述藥材的表面、質地及斷面特征，黑籽重樓根莖粗細不規則，幼齡根莖纖細，俗稱“螞蟥重樓”[9]。根莖呈結節狀扁圓柱形，略彎曲，根莖長5～12 cm，粗0.8～3 cm，表面黃褐色，內切面白色，有層狀突起的環紋，節較疏，多環節，結節上可見凹陷的莖痕及須根，頂端殘留有莖基和鱗葉。質堅實，斷面平坦，粉性或角質，呈白色或淺棕黃色。氣微，味微苦、麻。黑籽重樓的根莖干燥品形態見圖2。

2.3 顯微鑒別

2.3.1 根莖橫切面顯微鑒別 取黑籽重樓根莖制作石蠟切片，采用生物組織自動脫水機脫水、生物組織冷凍、包埋機包埋、生物組織切片機切片、染色、干燥、檢視，在顯微鏡下觀察組織特征。結果，根莖表皮細胞1列，不規則，類圓形或類長方形，外壁較厚，排列緊密，脊線較密。皮層較中柱寬，細胞不規則形或類圓形，細胞中充滿淀粉粒，薄壁細胞間散有多數大的黏液細胞，內含草酸鈣針晶束，皮層中可見葉跡維管束和根跡維管束。內皮層不明顯。維管束呈散狀排列，大多為周木型維管束，為不規則形或類三角形，木質部細胞大，內分布有導管，呈斷續或連續環列于韌皮部的四周，韌皮部細胞小，排列緊密。黑籽重樓根莖橫切面顯微特征見圖3。

2.3.2 根莖粉末顯微鑒別 將自然干燥根莖粉碎后過80目篩的粉末，取少許粉末放于載玻片上，滴加水合氯醛溶液，于酒精燈外焰處加熱透化，反復透化3次，再滴加稀甘油溶液，封片，觀察細胞特征。另取少許粉末于另一個載玻片上，滴加稀甘油溶液，封片，觀察淀粉粒，在顯微鏡下觀察粉末特征。結果，根莖粉末為淺灰白色。淀粉粒眾多，多數為單粒，呈類圓形、橢圓形，臍點為點狀、星狀或一字形、人字形，直徑為2.82～18.75 μm；少數為復粒，常由2～3個分粒組成；草酸鈣針晶多呈束狀存在，少數散狀分布，長35～137.48 μm。薄壁細胞類長圓形或不規則形，內富含淀粉粒。可見螺紋、梯紋導管，直徑為11.93～25.98 μm。黑籽重樓根莖粉末顯微特征見圖4。

2.4 薄層檢識

分別取黑籽重樓及云南重樓對照藥材粉末0.5 g于圓底燒瓶中，加乙醇10 mL，加熱回流30 min，濾液作為供試品溶液；另取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含0.8 mg的單溶液及混合溶液作為對照品溶液，按2015年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB薄層色譜法試驗，分別取供試品溶液和對照品溶液各5 ?L，分別點樣于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（15 ∶ 5 ∶ 1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干。結果，在紫外光（365 nm）下，供試品溶液與重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對照品溶液色譜相應位置上出現相同顏色的熒光斑點，說明黑籽重樓中含有重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ這4種成分。黑籽重樓的薄層色譜圖見圖5。

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～40 min， 30%→60%A；40～50 min， 60%→30%A）；檢測波長：203 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 ?L。

2.5.2 溶液的制備 （1）混合對照品溶液。精密稱取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的對照品適量，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成質量濃度分別為0.46、0.40、0.52、0.48 mg/mL的混合對照品溶液，混勻，置于冰箱中（4 ℃）保存，備用。（2）供試品溶液。取黑籽重樓的粉末約0.5 g，精密稱定，置于具塞圓底燒瓶中，加入乙醇25 mL，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，用乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，濾液作為供試品溶液。

2.5.3 系統適用性試驗 精密量取“2.5.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，在該色譜條件下，各待測成分間、待測成分與雜質峰間均能達到基線分離要求，分離度>1.5，理論板數按重樓皂苷Ⅰ計不低于5 000。高效液相色譜圖見圖6。

2.5.4 線性關系考察 取“2.5.2”項下混合對照品溶液 0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 mL，加入甲醇溶液定容至1 mL，混勻后按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的進樣量為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，結果見表1。

2.5.5 精密度試驗 精密量取“2.5.2”項下混合對照品溶液10 μL，按“2.5.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ峰面積的RSD分別為0.71%、1.06%、0.87%、1.25%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩定性試驗 取“2.5.2”項下供試品溶液（批號：20170706），分別于室溫下放置2、4、6、8、10、24 h時按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ峰面積的RSD分別為1.67%、1.70%、1.67%、1.75%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.5.7 重復性試驗 分別精密量取6份供試品溶液（批號：20170706），每份1 mL，按“2.5.1”項下色譜條件連續測定6次。結果，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ峰面積的RSD分別為1.84%、1.41%、1.10%、1.10%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.5.8 加樣回收試驗 精確量取6份供試品溶液（批號：20170706），每份1 mL，分別加入“2.5.2”項下混合對照品溶液5 mL，再按“2.5.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的平均回收率分別為98.23%、99.32%、97.46%、97.86%，RSD分別為1.63%、1.37%、1.89%、1.92%（n=6），表明方法的準確度良好。

2.5.9 樣品含量測定 取3批樣品各適量，分別按“2.5.2”（2）項下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表2。

2.6 結果

經查閱文獻[14]，黑籽重樓與其他種的特征區別主要有以下幾點：（1）植物形態。黑籽重樓的原植物特征包括具有側膜胎座，果開裂，無外種皮，于一側包以深紅色多汁的雞冠狀假種皮；黑籽重樓與長柱重樓、毛重樓、云南重樓、七葉一枝花在植物形態上的區別，主要表現在胎座的類型、果是否開裂、有無外種皮、葉是否有毛、花瓣的形狀等方面。（2）藥材性狀特征。黑籽重樓與云南重樓、七葉一枝花在藥材性狀上的區別主要表現在表面顏色、形狀、環紋、斷面上，氣味上沒有明顯的差異。（3）顯微特征。黑籽重樓的橫切面結構、粉末特征與云南重樓、七葉一枝花沒有明顯差異。（4）化學成分定性與定量分析。經薄層色譜鑒別，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ這4種成分在黑籽重樓根莖中都有，且含量分別為0.117%、0.081%、0.114%、0.204%。2015年版《中國藥典》（一部）規定的含重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量不得少于0.60%的限量標準[4]，本文研究的黑籽重樓中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的總量為0.516%，與藥典標準（總量不得少于0.60%）存在差異。

3 討論

通過對中藥的大力研究，生藥學在我國有了長遠的發展，生藥學對于準確識別、鑒定中藥基源的種類，調查、考證中藥的資源起到了極大地推進作用[15]。通過對黑籽重樓系統的生藥學研究，可為黑籽重樓的鑒定及進一步研究提供科學依據。查閱文獻[16]得知，重樓對土壤中不同營養成分具有選擇性，在富饒的土壤中，速效磷和速效鉀的供應有利于重樓根莖中總皂苷和總多糖的合成與積累，說明土壤營養成分對重樓屬植物根莖主要活性成分的含量高低存在一定的影響，不同的產地、不同的土壤，重樓屬植物根莖的活性成分是存在差異的。所以，在栽培過程中可根據重樓屬植物的需肥特性及生長規律有針對性地合理施肥，從而使其根莖的品質達到最佳水平。

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（收稿日期：2018-06-28 修回日期：2018-09-26）

（編輯：余慶華）