基于網絡藥理學研究溫膽湯治療冠心病的作用機制

吳俊穎 張璐 謝銥子 孫治中 紀樹亮 孫偉鵬 李先濤

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）23-3227-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.13

摘 要 目的：基于網絡藥理學研究溫膽湯治療冠心病的作用機制。方法：以化合物的口服藥物生物利用度（OB）和類藥性（DL）為標準，借助中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）、OMIM和Genecards數據庫、反向分子對接服務器（DRAR-CPI）篩選并預測溫膽湯的活性成分及治療冠心病的作用靶標。借助Cytoscape 3.6.0軟件構建溫膽湯活性成分-冠心病作用靶標網絡；借助STRING數據庫構建靶蛋白相互作用（PPI）網絡，篩選連接度（PPI網絡中節點通過邊的個數）排名前5的靶蛋白，并利用分子對接服務器預測其與活性成分的結合活性。通過生物學信息注釋數據庫（DAVID）對靶點基因本體（GO）生物過程和京都基因與基因組百科全書（KEGG）中代謝通路進行分析。結果：從溫膽湯中共篩選出147個活性成分，143個與冠心病相關的作用靶點，包括白蛋白、載脂蛋白E、白細胞介素6、腫瘤壞死因子、C反應蛋白等。經分子對接分析，溫膽湯活性成分與靶蛋白結合能力較強。經GO和KEGG通路富集分析，參與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄調控、膽固醇代謝、低氧反應、藥物反應、炎癥反應等多種生物過程，調節包括脂肪細胞脂解作用通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、脂肪消化與吸收通路、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、腎素-血管緊張素等通路。結論：溫膽湯的活性成分能通過多個靶點、多條通路發揮治療冠心病的作用，本研究結果為進一步研究溫膽湯的藥理作用提供了參考依據。

關鍵詞 溫膽湯；作用機制；冠心病；網絡藥理學；中藥系統藥理學分析平臺

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the mechanism of Wendan decoction in the treatment of coronary heart disease based on network pharmacology. METHODS： Using oral bioavailability （OB） and drug like （DL） as reference， the active components of Wendan decoction， targets for treatment of coronary heart disease were screened and predicted by utilizing TCMSP， OMIM and Genecards database， DRAR-CPI. Cytoscape 3.6.0 software was adopted to construct an active component-coronary heart disease target network. The protein-protein interaction （PPI） network was established by using STRING database. Top 5 target proteins in the list of connectivity （the number of nodes passing through edges in PPI network） were screened. The activities of target protein with active components were predicted by molecular docking server. DAVID database was used to analyze metabolism pathway in target gene ontology （GO） biological process， Kyoto encyclopedia of genes and gnomes （KEGG）. RESULTS： A total of 147 active components and 143 targets related to coronary heart disease were screened， including albumin， apolipoprotein E， IL-6， TNF and C reactive protein， etc. After molecular docking analysis， the binding ability of active ingredients to target proteins was strong. Through GO and KEGG pathway enrichment analysis， active components participated in RNA polymerase Ⅱ promoter transcription regulation， cholesterol metabolism， hypoxia， drug reaction， inflammation and other biological processes， and regulated fat cell lipolysis pathway， cytokine-cytokine receptor interaction pathway， fat digestion and absorption pathway， peroxisome proliferator-activated receptor signaling pathway， renin-angiotensin pathway and so on. CONCLUSIONS： The active components of Wendan decoction play a role in the treatment of coronary heart disease through multiple targets and pathways. The results of this study provide a reference for further study of the pharmacological effect of Wendan decoction.

KEYWORDS Wendan decoction； Mechanism； Coronary heart disease； Network pharmacology； TCMSP

冠狀動脈性心臟病（簡稱“冠心病”）是由冠狀動脈粥樣硬化病變引起的心臟疾病。在我國，冠心病患者每年以20%的速度增加，病死人數約為所有心臟疾病的10%～20%[1]。冠心病在祖國醫學中可歸入心痹、胸痛等范圍，病位在心，也可涉及肝、脾、腎；兼有痰濁、血瘀、氣滯、寒凝等病變[2]。人飲食不節、身體虛弱、脾胃不運則生痰濁，濁郁結而成瘀，痰瘀互結胸中則成胸痹[3]。

溫膽湯來源于唐代《千金方》，為中醫學經典方劑之一。該方由半夏（君藥）、陳皮、竹茹、枳實、甘草、茯苓組成，有理氣化痰、利膽合胃的功效，治療由于痰瘀閉阻導致的心痹、胸痛等[4]。西醫研究表明該方對冠心病有一定的治療效果，能夠改善心肌供血，使冠心病的癥狀得到緩解[5]。溫膽湯中半夏具有抗心律失常、鎮靜催眠的作用[6]；陳皮具有良好的改善心腦血管疾病的作用[7]；茯苓具有可增強機體免疫功能的作用[8]；甘草具有拮抗烏頭堿、哇巴因等藥物引起的心律失常的作用，保護心肌收縮，具有明顯的抗心肌缺血活性[9]。由此表明，本方各藥物可從多方面治療冠心病。

網絡藥理學是基于生物信息學、系統生物學、藥理學等多個學科的技術和知識，構建藥物的“活性成分-靶標-通路-疾病”網絡，探索藥物與疾病的關系，多層次地闡明藥物的作用機制的一種科學方法，具有整體性、系統性的特點，為中醫藥的研究提供了新的視角，并被廣泛運用[10]。本研究借助網絡藥理學，研究傳統方劑溫膽湯治療冠心病的作用機制，從而為溫膽湯進一步的藥理學研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 數據庫與軟件

中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，http：//ibts.hkbu. edu.hk/LSP/tcmsp.php）；有機小分子生物活性數據庫Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；反向分子對接服務器（DRAR-CPI，https：//cpi.bio-x.cn/drar/，服務器以Z-score表示活性成分與靶標的親和力，規定Z- score<-0.5時活性成分與靶標有潛在結合的可能性）；通用蛋白質數據庫（UniProt，http：// www.uniprot. org/uploadlists/）；人類基因數據庫GeneCards（http：//www.genecards.org/）；在線《人類孟德爾遺傳》數據庫（OMIM，http：//omim.org/）；網絡拓撲屬性分析軟件Cytoscape 3.6.0；蛋白互作平臺STRING數據庫（https：//string-db.org/）；分子對接服務器（http：//www.x-mol.com）；生物學信息注釋數據庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）；在線云平臺OmicShare網站（www.omicshare.com/tools，繪制通路信息圖）。

1.2 化學成分的收集與篩選

分別以“半夏”“陳皮”“茯苓”“甘草”“枳實”作為關鍵詞，通過TCMSP數據庫進行檢索，獲取所有中藥化學成分的相關信息，選取同時滿足口服利用度（OB）>30%，類藥性（DL）>0.18兩個條件的成分作為活性成分。OB為口服藥物的有效成分或活性基被吸收到達體循環并被吸收的速度與程度，OB值越高表示藥物的生物活性分子的類藥性DL越好[11]。然后通過Pubchem檢索出每一個活性成分的3D結構，以.mol2格式保存。

1.3 藥物作用靶標及冠心病靶標相應基因的獲取

將檢索得到的藥物活性成分的.mol2格式文件逐一上傳至DRAR-CPI服務器，按照服務器推薦選取Z- score<-0.5作為藥物的預測靶標。通過UniProt數據庫將得到的藥物靶標編號（PDB ID號）轉換成Genecards數據庫對應的基因名稱（Gene name）。在Genecards數據庫和OMIM數據庫中輸入關鍵詞“Coronary heart disease”或“CAD”，收集與冠心病相關的靶標基因。最后各藥物靶標與靶標進行比對，篩選出共同靶標基因，得到溫膽湯治療冠心病的靶點。

1.4 活性成分-冠心病靶標網絡的構建

將半夏、陳皮、茯苓、甘草、枳實和竹茹的活性成分與冠心病作用靶標導入Cytoscape 3.6.0軟件，構建其溫膽湯的活性成分-冠心病靶標網絡。在網絡中，節點代表化合物、靶蛋白，邊代表活性成分-靶點的相互作用。

1.5 靶蛋白相互作用網絡構建

使用STRING數據庫檢索藥物及冠心病潛在靶標，物種設為“Homo sapiens”（人類），最低相互作用閾值設為中等置信度 “medium confidence” 0.4，其余參數保持默認設置，獲取相互作用關系，并運用Cytoscape 3.6.0軟件繪制其靶蛋白相互作用（PPI）網絡，然后使用Cytoscape 3.6.0軟件中的Network Analyzer進行網絡分析，并根據連接度（Degree，PPI網絡中節點通過邊的個數；連接度越大，該節點與其他節點聯系就更密切，在網絡中就越重要）調節節點的大小，繪制PPI網絡圖。

1.6 分子對接分析活性成分與靶蛋白的結合作用

分子對接是靶蛋白與藥物活性成分通過能量、化學環境等相互識別的過程。基于“1.5”項下的PPI網絡，篩選Degree值排名前5位的靶蛋白，導入分子對接服務器與半夏、陳皮、茯苓、甘草、枳實和竹茹的活性成分進行分子對接，并對分子對接結果的Docking score進行分析，預測、評價藥物活性成分與靶蛋白之間的結合活性（當Docking score值>7.0時，表示活性成分與靶蛋白結合能力較強，從而反映出預測結果的可靠性）。

1.7 基因本體生物過程與京都基因與基因組百科全書通路富集分析

將半夏、陳皮、茯苓、甘草、枳實和竹茹的作用靶標導入DAVID數據庫，進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG）通路富集和基因本體（Gene ontology，GO）生物過程富集分析。選取P<0.01的生物過程和通路，并且按照富集基因數從大到小排序，選取排名前20的生物過程和通路，使用OmicShare網站繪制通路信息圖。結合文獻檢索，篩選出治療冠心病的可能通路，找出通路上的溫膽湯治療冠心病的相關靶標，并與藥物相應的活性成分構建出“溫膽湯活性成分-冠心病靶標-KEGG通路”的多維網絡關系圖。

2 結果

2.1 溫膽湯主要化學成分的收集

根據OB>30%，DL>0.18，篩選出147個主要活性成分。半夏13個，包括生物堿、葡萄糖苷和脂肪酸等；陳皮5個，包括黃酮、生物堿和揮發油等；茯苓15個，包括多糖、三萜和脂肪酸等；甘草92個，包括甘草多糖、甘草甜素和黃酮類等；枳實22個，包括黃酮、香豆素和生物堿等。溫膽湯化學成分的基本信息見表1（本文篩選的活性成分較多，本表只列舉部分，且由于化學成分名稱過長，故以字母代替）。

2.2 溫膽湯作用靶標預測

通過DRAR-CPI服務器查找溫膽湯147個活性成分的靶標，得到Z-score<-0.5的靶蛋白405個。在Uniprot數據庫中輸入靶蛋白的PDB ID，獲得405個基因靶標。將所得基因靶標與OMIM與Genecards數據庫的冠心病相關基因作比對，篩選出可能與冠心病有關的靶基因143個。如載脂蛋白E（APOE）對應PDB ID為2XA6。

2.3 溫膽湯活性成分-冠心病靶標網絡構建

在Cytoscape 3.6.0軟件中導入溫膽湯的活性成分與冠心病作用靶標，構建活性成分-冠心病靶標網絡圖見圖1（圖中內圈六邊形節點代表活性成分，如半夏的活性成分10，13-二十碳二烯酸（D2）等；外圈圓形節點代表作用靶標，如APOE等）。

如圖1所示，此網絡共包括290個節點，784個邊。不同的節點代表溫膽湯潛在的活性成分與作用靶標。圖中溫膽湯中多個靶標可對應相同的活性成分，一個靶標也可與不同的活性成分相對應，可見溫膽湯治療冠心病具有多成分、多靶標的特點。

2.4 靶蛋白PPI網絡分析

將溫膽湯可能與冠心病相關的143個靶蛋白導入STRING數據庫獲取的相互作用關系，使用Cytoscape 3.6.0繪制靶蛋白PPI網絡圖，靶蛋白PPI網絡圖見圖2（圖中英文縮寫為靶基因名稱，如ALB表示是白蛋白）。

如圖2所示，此網絡共包括143個節點，429個邊，圖中degree值越大則節點越大，結果提示溫膽湯治療冠心病的靶標中Degree值排名前5的靶蛋白為ALB、APOE、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、C反應蛋白（CRP）。

2.5 分子對接分析結果

Degree值越大表示靶蛋白在溫膽湯治療冠心病中具有重要作用。本文選取PPI網絡中Degree值排名前5的關鍵靶蛋白ALB、APOE、IL-6、TNF、CRP與活性成分進行分子對接驗證。靶蛋白與溫膽湯147個活性成分的對接結果詳見圖3。

如圖3所示，橫坐標代表不同Docking score值分區，縱坐標代表5個靶蛋白靶標分別對應的活性成分的數目。結果有99個分子對接Docking score值>7.0，其中ALB 13個、APOE 26個、IL-6 18個、TNF 24個、CRP 18個，由此說明溫膽湯的活性成分與靶蛋白的結合能力較強。

2.6 GO生物過程和KEGG代謝通路富集分析

以P<0.01為閾值篩選排名前20的GO生物過程和KEGG代謝通路。溫膽湯治療冠心病GO生物過程見圖4，溫膽湯治療冠心病KEGG代謝通路見圖5。

由圖4、圖5可知，溫膽湯治療冠心病GO生物過程有RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄調控、膽固醇代謝過程、低氧反應、藥物反應、炎癥反應等；溫膽湯治療冠心病KEGG代謝通路有脂肪細胞脂解作用通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、脂肪消化與吸收通路、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）信號通路、腎素-血管緊張素、NF-κB信號通路、PI3K-Akt信號通路等。

2.7 溫膽湯活性成分-冠心病靶標-KEGG通路網絡構建

通過閱讀文獻從排名前20的KEGG代謝通路中選出可能與冠心病相關的通路，并將其與溫膽湯的活性成分、冠心病靶標構建“溫膽湯活性成分-冠心病靶標-KEGG通路”的多維網絡圖，見圖6。結果表明，溫膽湯治療冠心病的過程涉及多個活性成分、靶標及通路。

3 討論

溫膽湯的應用范圍廣泛，在神經精神系統、消化系統、心血管系統和呼吸系統等疾病中均有良好療效[4]。近年來，溫膽湯在心血管系統疾病的應用十分廣泛，取得了明顯的治療效果，尤其是在冠心病上。有文獻薈萃分析結果顯示，溫膽湯加減聯合西醫常規治療比單純的西醫常規治療冠心病效果更好[12]。中醫學認為，本虛標實為冠心病固有的病理性質，其中以氣虛、陰傷、陽衰為本，以瘀血、痰濁、寒凝、氣滯為標。臨床辨證論治，屬痰熱擾心者用溫膽湯治療。此方涼溫并用，不寒不燥；化痰與理氣并用，氣順痰消，可使痰熱去而心脈通。現有研究表明，溫膽湯的類方黃連溫膽湯具有降低血脂、減小主動脈斑塊面積與抑制動脈粥樣硬化病程進展的作用[13]，這在某一程度上大大降低了冠心病的發病的危險因素。但由于中藥方劑具有多成分、多靶點、多途徑的特征[14]，作用機制復雜多樣，溫膽湯治療冠心病的具體作用機制至今尚未完全明了。

本研究借助網絡藥理學，對傳統中醫方劑溫膽湯治療冠心病的作用機制進行探索。經藥物化學成分分析，共收集到溫膽湯治療冠心病的活性成分147個，如生物堿、葡萄糖苷、脂肪酸、黃酮類、三萜類、脂肪酸、甘草多糖、甘草甜素、香豆素類等；篩選出與冠心病相關的作用靶標143個；提示溫膽湯治療冠心病具有多成分、多靶標的特點。PPI網絡呈現出溫膽湯治療冠心病的各蛋白靶標之間關系密切，提示其作用機制復雜多樣，非單一蛋白靶標作用而成。分子對接結果也顯示溫膽湯的活性成分與關鍵靶標之間結合能力良好，說明本研究數據及結果準確度較高，在此基礎上進行網絡分析結果可信度較高，具有參考價值。PPI網絡中排名前5的靶蛋白有APOE、IL-6、TNF等，表明溫膽湯治療冠心病可能與調節脂質代謝、降低炎癥反應有關。GO生物過程和KEGG代謝通路富集分析結果顯示，溫膽湯治療冠心病涉及脂肪細胞脂解作用通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、NF-κB信號通路、PI3K-Akt信號通路等。臨床研究表明，NF-κB信號通路的活化可加速急性冠狀動脈綜合征的進程[15]。PI3K-Akt通路對冠心病的發生發展有特殊作用，可通過調節心肌細胞凋亡、血管內皮再生、物質代謝、炎癥反應影響冠心病的發展進程[16]。本研究結果顯示，溫膽湯治療冠心病與NF-κB、PI3K-Akt信號通路相關。

本研究結果表明，溫膽湯治療冠心病的過程涉及了多個活性成分、靶標及通路，與中醫藥治療疾病多成分-多靶標-多通路的作用特點相符合；同時，本研究也可作為一種分子機制的預測探討，為進一步研究溫膽湯治療冠心病的作用機制提供思路和參考。

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（收稿日期：2018-07-03 修回日期：2018-10-23）

（編輯：唐曉蓮）