HPLC—CAD法同時測定風濕定片中7種活性成分的含量

侯愛榮 邢曄忠 吳雪松

中圖分類號 R917；R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）23-3212-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.10

摘 要 目的：建立同時測定風濕定片中甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜堿、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素含量的方法。方法：采用高效液相色譜-電霧式檢測器（HPLC-CAD）法。色譜柱為Thermo Hypersil BDS C18，流動相為乙腈-10 mmol/L甲酸銨（甲酸調pH至4.5，梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，CAD霧化器溫度為35 ℃，氣壓為（59.6±0.1） psi，檢測頻率為10 Hz，進樣量為20 μL。結果：甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜堿、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素檢測質量濃度線性范圍為0.42～16.80、0.28～11.20、0.16～6.20、0.98～39.40、1.02～41.00、0.11～4.40、0.10～3.80 μg/mL（r≥0.999 1）；檢測限分別為0.03、0.02、0.02、0.03、0.03、0.02、0.02 μg/mL，定量限分別為0.11、0.06、0.06、0.10、0.11、0.08、0.07 μg/mL；精密度、穩定性（48 h）、重復性試驗的RSD均<2.0%（n=6或n=7）；平均回收率為98.61%～99.76%，RSD為1.11%～1.51%（n=6）。結論：建立的方法操作簡便、靈敏度高、結果準確，可用于風濕定片中甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜堿、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素含量的同時測定。

關鍵詞 高效液相色譜-電霧式檢測器法；風濕定片；水楊苷；毒藜堿；丹皮酚；歐前胡素；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of glycyrrhizic acid， salicin， glycyrrhetinic acid， chenopodium， paeonol， imperatorin and isoimperatorin in Fengshiding tablet. METHODS： HPLC-CAD method was adopted. The determination was performed on Thermo Hypersil BDS C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-10 mmol/L ammonium formate （pH value adjusted to 4.5 using formic acid， gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 35 ℃. CAD atomizer temperature was 35 ℃， and air pressure was （59.6±0.1） psi. The detection frequency was 10 Hz， and sample size was 20 μL. RESULTS： The linear range of glycyrrhizic acid， salicin， glycyrrhetinic acid， chenopodium， paeonol， imperatorin and isoimperatorin were 0.42-16.80， 0.28-11.20， 0.16-6.20， 0.98-39.40， 1.02-41.00， 0.11- 4.40， 0.10-3.80 μg/mL（r≥0.999 1）， respectively. The detection limits were 0.03， 0.02， 0.02， 0.03， 0.03， 0.02， 0.02 μg/mL， respectively； quantitation limits were 0.11， 0.06， 0.06， 0.10， 0.11， 0.08， 0.07μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability （48 h） and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6 or n=7）. Average recoveries rate were 98.61%-99.76%， and RSDs were 1.11%-1.51% （n=6）. CONCLUSIONS： The established method is simple， sensitive， accurate， and can be used for simultaneous determination of glycyrrhizic acid， salicin， glycyrrhetinic acid， chenopodium， paeonol， imperatorin and isoimperatorin in Fengshiding tablet.

KEYWORDS HPLC-CAD； Fengshiding tablet； Salicin； Chenopodium； Paeonol； Imperatorin； Content determination

風濕定片由八角楓、徐長卿、白芷及甘草這4味中藥組成，有散風除濕、通絡止痛的功效，用于風濕阻絡所致的痹病、癥見關節疼痛以及風濕性關節炎、類風濕性關節炎、肋神經痛、坐骨神經痛見上述證候者[1]。研究表明，毒藜堿為八角楓中松弛肌肉的活性成分，也是主要毒性成分[2]，水楊苷為八角楓解熱鎮痛的主要活性成分，對關節炎有治療作用[3]；丹皮酚為徐長卿中主要活性成分，具有抗炎及免疫調節作用[4]；以歐前胡素及異歐前胡素為代表的香豆素類成分是白芷鎮痛抗炎的活性成分[5]；甘草酸及甘草次酸是甘草的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化作用[6]。風濕定片現行質量標準收載于2015年版《中國藥典》（一部）中[1]，其含量測定項僅以丹皮酚為指標性成分，且關于風濕定片質量研究的文獻也未見3種以上的多成分質量控制[7-9]，由于中藥復方制劑化學成分復雜，僅控制其中少量成分含量，很難全面反映其質量。

電霧式檢測器（CAD）是近年來發展起來的一種新型檢測器，與傳統的紫外檢測器、二極管陣列檢測器（DAD）、蒸發光散射檢測器比較，具有靈敏高、重現性好等優點[10]。本試驗建立高效液相色譜（HPLC）-CAD法同時測定風濕定片中甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜堿、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素的含量，以期為完善風濕定片的質量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

3000 HPLC儀，包括Corona Veo CAD（美國Thermo Fisher公司）；KQ -400DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP千分之一天平、CPA225D十萬分之一天平、MSE百萬分之一天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

風濕定片（陜西君碧莎制藥有限公司，規格：0.22 g×16片×2板/盒，丹皮酚含量≥1.0 mg/片，共6批，批號分別為20170602、20170712、20170923、20180310、2018- 0325、20180516；江西濟民可信藥業有限公司，規格：0.22 g×12片×2板/盒，丹皮酚含量≥1.0 mg/片，共3批，批號分別為20171109、20171222、20180320）； 甘草酸對照品（日本和光純藥工業株式會社，批號：070-06021，純度：99%）；水楊苷對照品（批號：132590050，純度：99%）、毒藜堿對照品（批號：458980010，純度：98%）均購自比利時Acros公司；甘草次酸對照品（批號：110723-201715，純度：98%）、丹皮酚對照品（批號：110708-201407，純度：97%）、歐前胡素對照品（批號：110826-201616，純度：99%）、異歐前胡素對照品（批號：110827-201812，純度：98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，乙腈、甲酸、甲酸銨為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-10 mmol/L甲酸銨（B，甲酸調pH至4.5），梯度洗脫（0～8 min，15% A；8～30 min，15%～25% A；30～35 min，25%～30% A；35～45 min，30%～55% A；45～50 min，55%～70% A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL ；CAD霧化器溫度：35 ℃，氣壓：（59.6±0.1） psi，檢測頻率：10 Hz。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取甘草酸、水楊苷、甘草次酸、歐前胡素及異歐前胡素對照品適量，分別置于10 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，分別制成含甘草酸、水楊苷、甘草次酸、歐前胡素及異歐前胡素分別為0.84、0.56、0.31、0.22、0.19 mg/mL的對照品貯備液；分別精密稱取毒藜堿及丹皮酚適量置于10 mL量瓶中，并分別精密移取甘草酸、水楊苷、甘草次酸、歐前胡素及異歐前胡素的對照品貯備液各1.0 mL置于同一10 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，分別制成含甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜堿、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素質量濃度分別為0.084、0.056、0.031、0.197、0.205、0.022、0.019 mg/mL的混合對照品母液；精密移取混合對照品母液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜堿、丹皮酚、歐前胡素、異歐前胡素質量濃度分別為0.008 4、0.005 6、0.003 1、0.019 7、0.020 5、0.002 2、0.001 9 mg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品10片，去除糖衣并精密稱定，研細，取約0.2 g，置于50 mL量瓶中，加70%甲醇30 mL，45 ℃超聲（功率：220 W，頻率：30 kHz） 處理40 min，放冷，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按處方比例及制法[1]分別制備不含八角楓、徐長卿、白芷及甘草的4種陰性樣品，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法提取，分別得缺八角楓、缺徐長卿、缺白芷及缺甘草的陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液（批號：20170602）和缺八角楓、缺徐長卿、缺白芷、缺甘草的陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結果，甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜堿、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素與其他組分色譜峰的分離度均不低于1.5，理論板數以甘草酸計不低于 8 000，陰性對照溶液圖譜顯示各陰性樣品均無干擾。高效液相色譜圖見圖1。

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品母液1.0 mL，分別置于5、10、25、50、100、200 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，得不同質量濃度的系列溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，線性關系考察結果見表1。

2.5 檢測限與定量限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，逐級稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限；當信噪比為10 ∶ 1時，得定量限。結果， 甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜堿、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素的檢測限分別為0.03、0.02、0.02、0.03、0.03、0.02、0.02 μg/mL，定量限分別為0.11、0.06、0.06、0.10、0.11、0.08、0.07 μg/mL。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜堿、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素峰面積的RSD分別為1.52%、1.11%、1.33%、0.82%、0.91%、1.58%、1.19%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2” 項下供試品溶液（批號：20170602）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、12、24、48 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜堿、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素峰面積的RSD分別為0.92%、1.48%、1.32%、1.34%、1.21%、1.62%、1.78%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取樣品（批號：20170602）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜堿、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素含量的平均值分別為0.46、0.31、0.16、1.08、1.14、0.12、0.10 mg/片， RSD分別為1.39%、1.02%、1.32%、1.21%、1.09%、1.63% 、1.74%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收試驗

取樣品（批號：20170602）適量，共6份，每份約0.2 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加入甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜堿、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率，結果見表2。

2.10 樣品含量測定

取9批樣品各10片，除去糖衣，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表3。

3 討論

3.1 檢測器的選擇

取各成分對照品溶液采用DAD進樣并進行全波長掃描發現，甘草酸與甘草次酸的最大吸收波長均為250 nm，水楊苷、毒藜堿、丹皮酚最大吸收波長分別為269、259、274 nm，而歐前胡素、異歐前胡素分別在248、301 nm波長處有最大吸收，將以上各波長下樣品的DAD圖譜與CAD圖譜進行比較發現，CAD獲得的色譜峰個數顯著多于DAD，且靈敏度高、基線更平穩，故選擇CAD進行各成分的含量測定。

3.2 流動相的選擇

2015年版《中國藥典》（一部）[1]風濕定片的含量測定是以水-乙腈等度洗脫，但在實際應用中發現，除丹皮酚外，其他6種成分在該條件下均難以實現基線分離，且峰形拖尾。參考文獻[7-9]，本試驗考察了甲醇-三乙胺、甲醇-純水及乙腈-甲酸等流動相系統，均難以實現7種成分的基線分離，繼而本試驗對甲醇-10 mmol/L甲酸銨、乙腈-10 mmol/L甲酸銨、甲醇-10 mmol/L乙酸銨以及乙腈-10 mmol/L乙酸銨等流動相體系進行考察。結果，乙腈-10 mmol/L甲酸銨系統下各成分分離度較佳。本試驗還考察了采用甲酸分別調節pH值至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0及5.5，結果pH值為4.5時基線平穩，各色譜峰對稱度及理論板數均為最佳，故選擇乙腈-10 mmol/L甲酸銨（甲酸調pH至4.5）為流動相。

3.3 色譜柱的選擇

文獻[7-9]均采用Diamonsil C18為色譜柱進行分析，結果均發現該色譜柱條件下水楊苷峰形拖尾，且歐前胡素與異歐前胡素無法實現基線分離，在多種流動相系統中均難以改善。鑒于此，本試驗也對Waters XBridge C18、Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18以及Thermo Hypersil BDS C18等不同色譜柱進行考察比較，結果顯示Thermo Hypersil BDS C18色譜柱可以滿足檢測要求。

3.4 供試品制備方法的選擇

本試驗考察了體積分數為60%、70%、80%及純甲醇4種提取溶劑對各成分的提取效果，結果顯示，70%甲醇對風濕定片中7種成分的提取效果最佳。本試驗還考察了30、40、50 min等不同超聲處理時間以及40、45、50 ℃等不同超聲加熱溫度對待測成分提取的影響，結果45 ℃超聲40 min即可將7種待測成分提取完全，故選擇70%甲醇45 ℃超聲40 min為供試品制備方法，且本方法較2015年版《中國藥典》（一部）[1]及文獻[7，9]提取更加完全，且操作簡便易行。

3.5 含量測定結果分析

結果顯示，丹皮酚含量均符合2015年版《中國藥典》（一部）標準（1.0 mg/片）[1]。與文獻[7-9]的檢測結果比較，甘草酸含量與文獻報道基本一致，毒藜堿含量略有降低，丹皮酚及歐前胡素含量比文獻有所升高。除異歐前胡素外，兩個不同廠家樣品中的其他6種成分含量無顯著差異，同一廠家不同批次樣品亦無明顯的批間差異；本品中異歐前胡素含量相對較低，在本品的制劑工藝中[1]，未對白芷進行提取，而直接以細粉與其他藥材的提取濃縮液混合制粒壓片，可能由于原藥材質量批間差異且本試驗超聲提取不充分而導致部分批次樣品中異歐前胡素未檢出。

本試驗建立了HPLC-CAD法同時測定風濕定片中甘草酸、水楊苷、甘草次酸、毒藜堿、丹皮酚、歐前胡素及異歐前胡素的含量，該方法簡便、準確、重現性好，為風濕定片的質量研究提供了更加全面的方法。后續試驗中將采用所建立的方法對更多廠家樣品進行分析檢測與數據積累，以期形成更加準確、完善的風濕定片質量標準。

參考文獻

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（收稿日期：2018-08-17 修回日期：2018-09-27）

（編輯：余慶華）