LC—MS/MS法測定犬血漿中阿莫西林的濃度及其藥動學研究

張元元 王晨 張斗勝 周從亞 楊麗 趙榮生 翟所迪 張現化

中圖分類號 R969.1；R978.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）23-3193-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.06

摘 要 目的：建立測定犬血漿中阿莫西林濃度的方法，研究其藥動學特征。方法：取12只比格犬，灌胃阿莫西林膠囊250 mg，分別于給藥前和給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、8、10 h取血1.0～1.5 mL，以阿莫西林-d4為內標，血漿樣品經酸性乙腈沉淀后，采用液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）測定其中阿莫西林的血藥濃度。色譜條件為色譜柱Waters Atlantis dC18，流動相乙腈（含0.1%甲酸）-10 mmol/L甲酸銨水溶液（pH 4.5），采用梯度洗脫的方式，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量1 ?L；質譜條件為電噴霧離子源，正離子模式，掃描方式為多反應監測，離子源噴霧電壓5.5 kV，離子源溫度450 ℃，霧化氣壓力30 psi，加熱氣壓力40 psi，阿莫西林離子對m/z 366.2→113.9，內標離子對m/z 370.2→353.0，二者碎裂電壓分別為26、16 V，駐留時間均為200 ms。結果：阿莫西林檢測質量濃度在0.1～16 μg/mL范圍內線性關系良好（r=0.998 2），日內、日間精密度的RSD分別小于14.3%、11.8%（n=5），準確度為93.0%～112.0%（n=3）；提取回收率為58.9%～63.3%（RSD=3.3%，n=3），基質效應為2.8%（n=6），穩定性試驗的RSD均小于15%（n=3）。阿莫西林在犬體內的藥動學符合一室模型，t1/2為1.56 h、10 h內的藥-時曲線下面積（AUC0-10 h）為24 300 ng·h/mL、cmax為7 523 ng/mL。結論：該方法靈敏、準確、簡便、快速，可用于犬血漿中阿莫西林的血藥濃度測定及藥動學的研究。

關鍵詞 阿莫西林；液相色譜-串聯質譜法；比格犬；血藥濃度

ABSTRACT OBJECTIVE： To develop the method for the determination of amoxicillin concentration in dog plasma， and to study its pharmacokinetic characteristics. METHODS： Totally 12 Beagle dogs were collected and given Amoxicillin capsules 250 mg intragastrically. The 1.0-1.5 mL plasma samples were collected before medication， and 0.5， 1， 1.5， 2， 2.5， 3， 3.5， 4， 4.5， 5， 5.5， 6， 8， 10 h after medication. Using amoxicillin-d4 as internal standard （IS）， after precipitated with acidic acetonitrile， the plasma concentration of amoxicillin was determined by LC-MS/MS. The separation was performed on an Atlantis dC18 column with mobile phase consisted of acetonitrile （containing 0.1% formic acid）-10 mmol/L ammonium formate water solution （pH 4.5， gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 1 ?L. Mass spectrum condition included ESI， positive ion mode， multiple reaction monitoring， ion source spray voltage 5.5 kV， ion source temperature 450 ℃， atomizing gas pressure 30 psi， heater pressure 40 psi， ion pair m/z 366.2→113.9 and m/z 370.2→353.0 for amoxicillin and IS， fragmentation voltage 26 and 16 V， residence time 200 ms. RESULTS： The linear range of amoxicillin was 0.1-16 μg/mL （r=0.998 2）. RSDs of intra-day and inter-day were lower than 14.3% and 11.8% （n=5）. The accuracy was 93.0%-112.0% （n=3）. The extraction recoveries were 58.9%-63.3% （RSD=3.3%， n=3）， and matrix effect was 2.8%（n=6）. RSDs of stability test was lower than 15% （n=3）. By single compartment model， the pharmacokinetic parameters of amoxicillin included that t1/2 was 1.56 h， AUC1-10 h was 24 300 ng·h/mL and cmax was 7 523 ng/mL. CONCLUSIONS： The method is sensitive， accurate， simple and rapid. It is applied for the determination of amoxicillin concentration in the plasma of dog and the pharmacokinetic study of amoxicillin.

KEYWORDS Amoxicillin； LC-MS/MS； Beagle dog； Plasma concentration

阿莫西林（Amoxicillin）是一種半合成廣譜β-內酰胺類抗菌藥物。在化學結構上，由于羥基和氨基的引入，阿莫西林具有很好的耐酸性，比一般青霉素更適合口服且抗菌譜更廣，應用廣泛，但在臨床上可引起有多種不良反應[1-4]。青霉素類制劑普遍存在副反應，其中以阿莫西林的報道最多，因此必須嚴格控制其用量。由于阿莫西林分子中含有的β-內酰胺結構，在水、強酸、強堿及青霉素酶等的作用下容易水解破裂，進而失去活性，甚至聚合產生致敏性雜質，導致人體產生嚴重的過敏反應。因此，在開展仿制藥一致性評價之前，需對仿制藥的藥動學、藥效學及毒理學性質進行全面的評估。本研究參考已報道的阿莫西林血藥濃度的液質聯用檢測方法[5-10]，并加以改進，建立了一種更加穩定、樣本需要量更少的液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS），并考察將其用以研究阿莫西林在比格犬體內的藥動學特征，以期為阿莫西林的質量監控提供一種新的檢測方法。

1 材料

1.1 儀器

液質聯用儀，包括Shimadzu 20AD液相色譜儀（日本島津公司）；Sciex 5500 QTrap質譜儀（美國Sciex公司）；MS3 digital渦旋混合器（德國IKA公司）；BT25S電子天平（德國Sartorius公司）；3-18K離心機（美國Sigma公司）；Cascada-I純水機（美國Pall公司）。

1.2 藥品與試劑

阿莫西林對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：30409-201011，純度：85.8%）；阿莫西林-d4標準品（內標，美國TRC公司，批號：7-YHH-23-1，純度：96.0%）；阿莫西林膠囊（中國某藥企提供，批號：01，規格：每粒250 mg）；乙腈、甲酸、醋酸銨以及甲酸銨均為色譜純。

1.3 動物

比格犬，普通級，♀♂各6只，8～12月齡，體質量為7.78～9.48 kg，來源于北京日新科技有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（京）2016-0004。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 溶劑 0.01 mol/L醋酸銨緩沖液（pH 4.5）-甲醇 （1 ∶ 1，V/V）溶液。

2.1.2 對照品溶液 精密稱取阿莫西林對照品適量，用溶劑配制成質量濃度為1.0 mg/mL的對照品貯備液，再用溶劑稀釋制成所需質量濃度的對照品溶液，-20 ℃下保存備用。

2.1.3 內標溶液 取阿莫西林-d4標準品，直接用溶劑溶解配制成質量濃度為526.6 ?g/mL的內標貯備液，再用溶劑稀釋成質量濃度為52.66 ?g/mL的內標溶液，-20 ℃下保存備用。

2.2 樣品前處理

精密吸取100 μL血漿，置于1.5 mL離心管中，加入內標溶液5 μL，渦旋混合后加入400 μL乙腈（含0.3%甲酸），渦旋1 min，4 ℃條件下15 000 r/min離心5 min，取上清液進樣。

2.3 色譜條件與質譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Waters Atlantis dC18（150 mm×2.1 mm，5.0 μm）；流動相A為乙腈溶液（含0.1%甲酸），流動相B為10 mmol/L甲酸銨水溶液（pH 4.5），梯度洗脫（0～1.3 min，99%B；1.3～3 min，99%B→8%B；3～4 min，8%B；4～4.1 min，8%B→99%B；4.1～7 min，99%B）；流速為0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為1 μL。

2.3.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI），以正離子模式、多反應監測（MRM）掃描方式進行定量。離子源電壓為5.5 kV，離子源溫度為450 ℃，霧化氣壓力為30 psi，加熱氣壓力為40 psi。阿莫西林離子對為m/z 366.2→113.9，碎裂電壓為26 V；內標離子對為m/z 370.2→353.0，碎裂電壓為16 V，駐留時間均為200 ms。

2.4 專屬性

取6只比格犬，分別取空白血漿各100 μL作為雙空白血漿樣品；另取空白血漿95 μL，分別加入溶劑5 μL作為單空白血漿樣品；再取空白血漿95 μL，加入阿莫西林對照品，制成0.1 μg/mL的含藥血漿樣品；以給藥后1 h的血漿樣品作為待測樣品，除雙空白血漿樣品不加入內標外，其余均按“2.2”項下方法處理后，進樣檢測，記錄色譜圖，并與阿莫西林+內標溶液的色譜圖進行對比。結果顯示，阿莫西林與內標的保留時間均為1.72 min左右，雙空白血漿樣品中內源性物質對于阿莫西林和內標的測定均無干擾，單空白血漿樣本中內標對于阿莫西林的測定也無干擾。表明該色譜條件專屬性較好。色譜圖見圖1。

2.5 線性關系與定量下限

取空白血漿95 μL，加入相應濃度的對照品溶液，制備成質量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、16 μg/mL的標準曲線樣品溶液，按“2.2”項下方法處理后，進樣測定，記錄峰面積。以阿莫西林與內標峰面積之比為縱坐標（y）、阿莫西林的質量濃度為橫坐標（x）進行回歸分析，權重為1/x2。得回歸方程為y=0.00 035 x-0.000 375（r=0.998 2），阿莫西林的檢測質量濃度線性范圍為0.1～16 μg/mL，定量下限為0.1 μg/mL。

2.6 精密度與準確度

取空白血漿95 μL，加入相應質量濃度的對照品溶液，制成質量濃度分別為0.1、0.3、2.5、8.0、12.0 μg/mL的質控樣品，每個濃度平行配制5份，按“2.2”項下方法處理后，進樣測定，記錄峰面積，考察批內精密度，并以測得值/真實值×100%計算批內準確度。同法在3 d內配制并測定3批次樣品，考察批間精密度和批間準確度。精密度與準確度結果見表1。

2.7 提取回收率

取空白血漿95 μL，加入阿莫西林對照品溶液制成質量濃度分別為0.3、2.5、8.0、12.0 μg/mL的質控樣品，加入400 μL乙腈（含0.3%甲酸）后，渦旋1 min，4 ℃條件下15 000 r/min離心5 min，取上清液，加入溶劑5 μL和內標溶液5 μL，渦旋混勻后吸取上清液進樣測定，計算阿莫西林與內標峰面積的比值AQC/AIS；另取空白血漿95 μL，加入溶劑5 μL，渦旋混勻后加入400 μL乙腈（含0.3%甲酸），渦旋1 min，4 ℃條件下15 000 r/min離心5 min，取上清液，加入相應質量濃度的阿莫西林對照品溶液和內標溶液制成同上濃度的樣品，渦旋混勻后吸取上清液進樣分析，計算阿莫西林與內標峰面積的比值AQC/AIS。以（AQC/AIS）/（AQC/AIS）×100%計算提取回收率，每個濃度平行做3份。結果顯示，0.3、2.5、8.0、12.0 μg/mL的質控樣品的提取回收率分別為63.3%、60.8%、59.3%、58.9%，平均提取回收率為60.6%，RSD為3.3%（n=4）。說明不同質控水平提取回收率變異均較小。

2.8 基質效應

分別取6只比格犬的空白血漿，各95 μL，加入溶劑5 μL，按“2.7”項下方法提取后，再加入0.3、12 ?g/mL質量濃度的對照品溶液5 μL和內標溶液5 μL，渦旋混勻后進樣測定，計算阿莫西林與內標峰面積的比值AQC/AIS；以純化水取代血漿，制備同上濃度的含阿莫西林和內標的純溶液，進樣測定，計算阿莫西林與內標峰面積的比值 AQC/AIS，計算內標歸一化基質效應因子（ISMF）=（AQC/AIS）/（AQC/AIS），并計算其RSD。結果顯示，在低、高濃度下，不同來源血漿中阿莫西林ISMF的RSD均為2.8%（n=6），符合2015年版《中國藥典》的要求。

2.9 稀釋效應

配制100 μg/mL的血漿樣本，用空白血漿稀釋10倍后，按“2.2”項下方法處理后，進樣測定，平行測定5份，考察精密度和準確度。結果顯示，峰面積的RSD為2.8%（n=5），準確度為107.4%，表明血漿樣品經10倍稀釋后，不影響其測定結果的準確性。

2.10 穩定性

2.10.1 標準溶液的穩定性 分別將阿莫西林貯備液（2 mg/mL）儲存于玻璃容器和塑料容器中，依次在室溫、4 ℃、-20 ℃條件下保存48 h、7 d、10 d、14 d，與新鮮配制的貯備液同時進樣分析，平行測定3次，考察標準溶液的穩定性。結果表明，阿莫西林室溫下穩定性最差， -20 ℃凍存穩定性最好；用塑料容器儲存降解速度低于玻璃容器。因此，本研究中標準溶液用塑料容器保存在-20 ℃條件下。樣品置于不同容器中的穩定性試驗結果見圖2。

2.10.2 含藥血漿穩定性 分別考察質量濃度分別為0.3、12.0 ?g/mL的含藥血漿在室溫下放置25 h、-80 ℃反復凍融3次、-80 ℃下放置58 d以及處理后4 ℃下放置120 h的穩定性，平行測定3次，考察準確度和RSD，結果見表2。

2.11 藥動學實驗

取12只比格犬，♀♂各半，單劑量灌胃阿莫西林膠囊250 mg，分別于給藥前（0 h）和給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、8、10 h取前肢靜脈血1.0～1.5 mL，分別置于有抗凝劑的離心管中，混勻后3 500 r/min離心10 min，取上層血漿，加入到1.5 mL塑料離心管中，保存于-80 ℃下待測。按本文建立的方法測定血漿樣品中阿莫西林的濃度，根據其變化發現阿莫西林在比格犬體內的轉運和清除符合一室模型。計算阿莫西林在比格犬體內的藥動學參數t1/2為1.56 h，藥-時曲線下面積（AUC0-10 h）為24 300 ng·h/mL，cmax為7 523 ng/mL，表觀分布容積為0.023 L，清除率為0.010 L/h，tmax為1.5 h。犬體內阿莫西林的藥-時曲線見圖3。

3 討論

由于阿莫西林本身化學極性較大且穩定性差，采用液液萃取法進行前處理回收率非常低，因此本研究采用酸性乙腈沉淀蛋白后直接進樣，操作簡單、快速。由于蛋白沉淀后易存在基質效應影響[5]，本研究采用同位素內標阿莫西林-d4，其理化性質與阿莫西林高度相似，可減小基質效應影響，提高方法的耐用性和檢測結果的準確性。此外，由于阿莫西林結構中含有四元環，穩定性較差，因此，本研究對阿莫西林的穩定性及保存條件進行了較為深入的考察，最終選擇塑料容器保存標準溶液（-20 ℃）及血漿樣本（-80 ℃）。在樣本制備和測定過程中，另還需要嚴格控制pH，以保證檢測結果的準確性。

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（收稿日期：2018-06-08 修回日期：2018-10-18）

（編輯：鄒麗娟）