乳酸菌發酵過程參數的研究

楊俊慧，馬恒，滿德恩，郭脈海，劉慶艾，馬耀宏，史建國*

(1.齊魯工業大學(山東省科學院)，山東省科學院生物研究所，山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250014；2.菱花集團有限公司，山東 濟寧 272032)

凡是能利用葡萄糖或乳糖發酵產生乳酸的細菌統稱為乳酸菌[1]，分為18個屬，共有200多種[2]。乳酸菌不僅在理論研究上具有重要的學術價值，是研究分類、生化、遺傳、分子生物學和基因工程的理想材料，在工業、農牧業、食品和醫藥等與人類生活密切相關的重要領域應用價值也極高。研究乳酸菌發酵過程中乳酸[3]、葡萄糖以及細胞數量等各參數的變化情況，可以更好地了解乳酸菌的發酵代謝過程，有利于發酵過程的調控。以往研究多局限于利用傳統手段控制過程參數，如通過分光光度計測量發酵過程中細胞生長曲線[4]，采用中和滴定法或比色法測定乳酸含量[5]等，對發酵過程中重要參數的變化規律缺乏深入便捷的測試方法。使用現代化在線控制系統實時監測乳酸菌發酵過程，可以為乳酸菌發酵研究以及實際生產過程中參數控制問題提供更加準確、便利的方法。

本文使用在線控制系統對乳酸菌發酵條件進行研究，通過KRH-BI0300型發酵罐控制系統、細胞密度監測系統、SHP8400PM過程氣體質譜分析儀、生物傳感分析儀等多種現代化發酵過程分析手段檢測發酵過程參數，準確且方便、快捷地掌握乳酸菌發酵過程主要指標的變化情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

乳酸菌L1(山東省科學院生物傳感器重點實驗室保藏)。

1.1.2 培養基

(1)斜面培養基：MC培養基(青島高科園海博生物技術有限公司)。

(2)種子培養基：MRS肉湯培養基(青島高科園海博生物技術有限公司)。

(3)發酵培養基：10.0 g/L葡萄糖(天津大茂化學試劑廠)；5.0 g/L酵母膏(國藥集團化學試劑有限公司)；5.0 g/L蛋白胨(國藥集團化學試劑有限公司)；2.0 g/L檸檬酸氫二銨(國藥集團化學試劑有限公司);1 mL/L吐溫80(國藥集團化學試劑有限公司)；5.0 g/L乙酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；2.0 g/L磷酸氫二鉀(國藥集團化學試劑有限公司);0.58 g/L硫酸鎂(國藥集團化學試劑有限公司);0.25 g/L硫酸錳(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 實驗儀器

KRH-BI0300型發酵罐(江蘇科海生物工程設備有限公司)；SHP8400PM過程氣體質譜分析儀(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；細胞密度監測系統(瑞士哈美頓博納圖斯股份公司)；SBA-40D生物傳感分析儀(山東省科學院生物傳感器重點實驗室)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；SW-CJ-2FD雙人單面垂直送風凈化工作臺(浙江蘇凈凈化設備有限公司)；303A電熱恒溫培養箱(南通宏大實驗儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌發酵實驗

1.3.1.1 菌株培養及保藏

將乳酸菌菌株接種于新鮮斜面培養基中，25 ℃培養24 h，再次進行接種培養24 h，放入4 ℃冰箱保藏，每隔一個月活化一次[6]。

1.3.1.2 種子培養

將乳酸菌菌株按10%接種量接種于種子培養基中，培養箱25 ℃靜置培養24 h。

1.3.1.3 發酵培養

將乳酸菌種子液按10%接種量接種于10 L發酵罐中，攪拌100 r/min，通氣0.5 L/min, 25 ℃培養至發酵結束。

1.3.2 過程參數分析方法

1.3.2.1 乳酸菌生長曲線測定

在細胞密度監測系統中，使用Incyte活細胞密度電極檢測乳酸菌生長過程中的活細胞數量變化情況。

1.3.2.2 發酵過程中pH測定

通過KRH-BIO3000發酵罐控制系統，使用pH電極檢測發酵過程中的pH變化。

1.3.2.3 發酵過程中乳酸、葡萄糖質量濃度測定

每隔2 h取樣，利用生物傳感器測定[7]浸泡液中乳酸、葡萄糖的含量，測定時每次為25 μL,響應時間20 s，測定周期小于2 min,誤差小于2%。樣品不需脫色、分離純化就可直接測定。

1.3.2.4 發酵尾氣成分測定

通過SP8400PM過程氣體質譜分析儀分析主要發酵尾氣成分。

2 結果與討論

發酵過程中乳酸菌的生長與乳酸的產生和葡萄糖的消耗密切相關，同時發酵過程中的pH、溶氧等參數對發酵過程也有重要影響。通過發酵在線控制系統實時檢測發酵過程中的參數變化，對乳酸菌發酵調控具有重要意義。

2.1 乳酸菌生長曲線測定

在細胞密度監測系統中測乳酸菌活細胞數量,其發酵過程變化情況如圖1所示。在交變電場中，活細胞相當于微小的電容，而死細胞或細胞碎片不能極化，形不成電容[8-9]。Incyte電極測量這些小容量電容器的電荷，并以介電常數顯示(pF/cm)。4 h時活細胞介電常數達到最大值，為0.57 pF/cm，繼續發酵，細胞數量逐漸減少，15 h后逐漸趨于平穩。

圖1 乳酸菌活細胞數量變化曲線Fig.1 The profile of the amount changing of lactic acid bacteria living cells

2.2 發酵過程中的pH變化情況

發酵過程中的pH是一個綜合性指標，pH通過影響代謝途徑中酶的活性、細胞膜的滲透性以及培養基中營養物質分解利用等因素進而影響微生物的生長繁殖和代謝產物的積累[10]。發酵過程中pH變化情況如圖2所示。發酵10 h時，乳酸菌生長產生乳酸使pH明顯下降。16 h后pH逐步穩定，因為乳酸菌生長進入衰亡期，乳酸產量趨于平穩。

圖2 發酵過程中pH變化曲線Fig 2 The profile of pH changing during fermentation

2.3 發酵過程中乳酸、葡萄糖質量濃度測定

乳酸菌發酵是一個消耗葡萄糖、生成乳酸的過程，乳酸菌發酵過程中的葡萄糖、乳酸變化情況見圖3、圖4。如圖3所示，發酵0～10 h過程中，發酵液中葡萄糖濃度逐步降低，10 h后葡萄糖濃度基本趨于穩定。如圖4所示，0～10 h乳酸濃度逐漸增加，10 h后基本趨于穩定。

圖3 發酵過程中葡萄糖、乳酸變化曲線Fig.3 The profile of glucose and lactic acid changing during fermentation

圖4 發酵過程中氣體體積分數變化曲線Fig.4 The profile of gas volume fraction changing during fermentation

2.4 發酵尾氣成分測定

罐內N2、O2、Ar、CO2等主要發酵尾氣組成體積分數的變化反映了整個發酵過程物質的變化情況[11]。發酵過程中尾氣變化情況如圖4所示。CO2的釋放在一定條件下與細胞量成正比，監測CO2的生成是跟蹤生長活動的有效方法。O2是構成細胞本身及代謝產物的組分之一，菌體的生長和產物的代謝均需要大量的O2。同時監測發酵罐中N2及Ar體積分數的變化可以充分了解尾氣中各種組成氣體所占比例，N2、Ar并不參與代謝過程，測定已知流速的進氣空氣和尾氣中的N2、Ar的體積分數并建立平衡方程，可以消除尾氣流速誤差帶來的影響[12]。隨著發酵的進行，罐內的氣體成分逐漸變化，CO2體積分數在5 h時開始升高，在7 h達到峰值后開始下降，20 h后逐漸趨于平穩；O2體積分數在5 h時開始下降，10 h后趨于平穩；N2體積分數在5 h時減少至最低點后逐漸增加直至趨于平穩，主要是因為罐內CO2體積分數增多，總體積不變的情況下N2占總體積分數減少，N2與O2體積分數減少量與CO2體積分數增加量基本相同。惰性氣體Ar的體積分數基本不變。

3 結論

在整個發酵過程中乳酸菌不斷繁殖，4～5 h乳酸菌活細胞數量達到最大值，同時發酵罐內乳酸菌發酵產生的CO2體積分數也達到最大值，O2消耗導致罐內O2體積分數達到最低點。隨著乳酸菌的生長繁殖，產物乳酸的增長時間與培養基中主要成分——葡萄糖的消耗時間基本吻合，說明乳酸菌利用葡萄糖代謝繁殖生成乳酸，乳酸濃度增加的同時引起發酵過程中的pH變化。分析檢測乳酸菌發酵過程中的主要參數，可以準確且方便、快捷地掌握乳酸菌生長繁殖情況，為乳酸菌代謝調控及其大規模工業化生產提供條件。