羊草葉綠體非編碼區多態性標記篩選及群體遺傳多樣性

楊艷婷，侯向陽，魏臻武，喬志宏，常春，任衛波，武自念*

(1.中國農業科學院草原研究所，內蒙古 呼和浩特010010；2.揚州大學動物科學與技術學院，揚州大學草業科學研究所，江蘇 揚州 225009)

羊草(Leymuschinensis)是歐亞大陸草原具有優勢的牧草和生態草之一，高產抗逆性強，分布范圍廣，為大多數畜牧動物所喜食，是恢復退化天然草原和建設優質人工草地極其重要的草資源[1]。羊草是歐亞大陸草原區東部草甸草原及典型草原的重要建群種，作為我國重要的牧草和生態草，羊草能適應多種環境條件，具有極豐富的遺傳多樣性，羊草種群之間也產生了不同的遺傳特征[2-3]。探討不同地理種群羊草的遺傳特性對于研究羊草分化起源及育種等具有重要的理論價值和實踐意義。

葉綠體基因是研究植物譜系地理學、系統學及種群歷史的首選材料。植物體內葉綠體基因進化速率較慢，僅為核基因的一半，且葉綠體DNA(chloroplast DNA，cpDNA)為母系遺傳，不會受基因重組的干擾，進化路線相對獨立[4-6]。葉綠體DNA非編碼區的核苷酸替換速率相對較高，有研究指出，葉綠體非編碼區因受到的限制較少，能產生比編碼區更多的變異位點，可以提供較多的具有系統學意義的信息位點[7-9]。目前,atpB-rbcL、trnL-trnF等葉綠體基因非編碼區廣泛應用于物種遺傳多樣性及譜系地理學研究。近年來,草本植物基于葉綠體非編碼區的研究也越來越多，吳娟子等[10]利用葉綠體基因非編碼區trnT-trnF序列分析了中國互花米草(Spartinaalterniflora)不同種群的遺傳結構，趙艷寧[11]利用cpDNA非編碼區trnL-trnF和trnH-psbA對短花針茅(Stipabreviflora)11個居群165個個體材料進行了分子譜系地理學研究，楊青松等[12]用cpDNApsbA-trnH序列對不同海拔的血滿草(Sambucusadnata)進行了遺傳結構分析。在整個葉綠體基因組中，非編碼區在核苷酸替代或插入/缺失突變上，都表現出比編碼區更快的進化速率，受越來越多的研究者青睞。

目前,人們對羊草葉綠體基因的研究主要集中在羊草與近緣種之間的系統發育學研究上。Sun[13]利用rbcL基因分析了披堿草屬與含羊草在內的小麥族18個物種24個個體之間的系統進化關系，構建系統發育樹,結果顯示,羊草與新麥草(Psathyrostachysfragilis)之間的親緣關系較近。羊草是賴草屬的一種，利用葉綠體基因間隔區進行屬內系統發育學的研究也有報道。Liu等[14]利用核基因ITS序列和葉綠體基因間隔區trnL-trnF序列對賴草屬及近緣種13個物種57個個體進行了系統進化分析，也得到羊草與新麥草有較近的親緣關系。Guo等[15]利用葉綠體基因間隔區trnQ-rps16序列分析了賴草屬25個物種36個個體之間的系統發育關系，并得到trnQ-rps16序列很有可能是區分賴草屬進化關系的最佳選擇。利用cpDNA非編碼區序列研究羊草種內遺傳多樣性及進化方面的報道較少，因而篩選出合適的多態性基因對進一步探討羊草種內系統進化、譜系地理關系極為重要。

本研究以9個不同地理位置的羊草居群為材料，分別對12個葉綠體非編碼區DNA片段進行測序，通過序列間變異程度分析，試圖從中找出變異相對豐富的cpDNA片段，并對所選材料的遺傳多樣性、遺傳分化、基因流、系統發育樹以及單倍型網絡圖進行分析，為研究羊草群體遺傳學，探討系統發生關系和進行譜系地理學研究，估測遺傳多樣性中心進而保護羊草種質資源，培育高產、抗旱、耐鹽堿優良羊草品種等方面的工作提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2016年8月在中國農業科學院草原研究所沙爾沁試驗基地羊草種質資源圃采集9個羊草居群37個個體鮮嫩葉片后液氮速凍(表1)，于-80 ℃冰箱保存備用。9個羊草居群的材料是來自不同地理位置的野生種質，每個居群的個體位置均以該GPS點為中心采樣，個體之間相距40 m，取整株植株后帶回，種植在羊草種質資源圃。

表1 羊草9個不同地理位置的居群信息Table 1 The information of 9 different geographic populations in L. chinensis

1.2 DNA提取與檢測

采用植物基因組DNA提取試劑盒提取羊草全基因組DNA，溶于Tris+EDTA(TE)緩沖液后在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳檢測并拍照，存于-20 ℃冰箱備用。植物基因組DNA提取試劑盒(DP-305)購自天根生化科技北京有限公司。

1.3 PCR擴增與測序

PCR擴增反應總體積為50 μL：2*Taq PCR MasterMix 25 μL，引物F、R各3 μL(10 μmol·L-1)，ddH2O 9 μL，DNA 10 μL(約200 ng)。擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，43～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃再延伸10 min；10 ℃保存。PCR擴增產物在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳檢測并拍照，PCR擴增產物送往上海生工生物工程股份有限公司進行雙向測序，測序引物與PCR反應引物相同。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(表2)。2*Taq PCR MasterMix購自天根生化科技北京有限公司。

1.4 序列比對與分析

使用Seqman軟件讀取序列，去除兩端峰圖信號雜亂的低質量堿基，并進行手工拼接和人工校對。用MEGA 5.0軟件進行序列比對，比對結果利用Dnasp 5.10軟件統計可變位點和簡約性信息位點；采用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹，并利用Network 5.0軟件進行單倍型網絡圖分析；利用GenAlEx 6.5進行分子變異分析(analysis of molecular variance,AMOVA)和Mantel檢驗；用PERMUT軟件來計算居群分化指數Gst與Nst值，并用1000次置換進行檢驗；利用Dnasp 5.10進行中性檢驗，獲得Tajima’sD和Fu’sFs值。

表2 12條葉綠體非編碼區片段引物信息Table 2 The primer of 12 different chloroplast non-coding fragments

2 結果與分析

2.1 羊草12條葉綠體序列分析及多態性篩選

9個羊草居群37個個體的12條葉綠體非編碼區序列全長8499 bp，插缺和變異位點數為99個，占序列長度的1.16%；變異位點數為28個，簡約性信息位點16個，插缺位點12處含2處長堿基插缺(表3)。序列ndhF-rpl32變異位點數最多，簡約性信息位點5個，分別發生在105、243、249、363和368 bp處，其次是序列trnL-trnF、trnC-ycf6、aptI-aptH，均有2個簡約性信息位點，各序列變異情況不同，整體來看所選羊草葉綠體非編碼區序列變異率不高，僅為0.33%。

2.2 基于4條葉綠體非編碼區片段的羊草種群遺傳多樣性和單倍型多樣性分析

所選羊草材料不同葉綠體非編碼區片段的遺傳多樣性不同，4條非編碼區片段合并后全長3075 bp，單倍型多態性(Hd)為0.928，核苷酸多態性(Pi)為0.00101。片段ndhF-rpl32具有相對較高的遺傳多樣性水平，所有居群的單倍型多態性(Hd)為0.778，核苷酸多態性(Pi)為0.00227，核苷酸平均差異數(K)為1.595(表4)，在4條基因片段中均最高。單倍型多態性(Hd)和核苷酸多態性(Pi)最小的序列是trnL-trnF，分別為0.00023、0.158。4條非編碼區片段合并后共檢測到15種單倍型，單倍型多樣性方差和標準差分別是0.00035、0.019。

4個葉綠體非編碼區片段的Tajima’sD值均為負值(表4)，且均不顯著(P>0.10)；序列trnL-trnF的D值最低，Tajima’sD=-1.08228，序列trnC-ycf6和aptI-aptH的Tajima’sD值均為-0.69971。序列合并后，Tajima’sD值為-1.08542，Fu’sFs值為-5.301，且不顯著(P>0.10)，說明羊草在進化的過程中遵循中性進化模式，推測可能經歷過群體擴張。

表3 12個葉綠體非編碼區片段多態位點統計Table 3 The polymorphism of 12 cpDNA non-coding fragments

注：a處堿基序列為AAATAATATATATGAAAGATATAATAAAGAGAAAAAAA，長38 bp；b處堿基序列為ATAGATTACTTTTTTATTATTGA，長23 bp。

Note: The sequence of a is AAATAATATATATGAAAGATATAATAAAGAGAAAAAAA with the length of 38 bp; the sequence of b is ATAGATTACTTTTTTATTATTGA with the length of 23 bp.

表4 基于4條葉綠體非編碼區片段羊草的遺傳多樣性和單倍型多樣性分析Table 4 The genetic diversity and haplotype diversity analysis in L. chinensis based on 4 cpDNA non-coding fragments

2.3 基于合并序列的不同羊草居群遺傳多樣性和單倍型多樣性分析

4條葉綠體非編碼區序列合并后羊草9個居群之間的多態性表現不同(表5)。居群Pop3、Pop7的遺傳多樣性水平最豐富，居群Pop3的核苷酸多態性(Pi=0.00153)和平均核苷酸差異(K=4.6667)最高，居群Pop7具有的單倍型數目最多，且核苷酸多態性(Pi=0.00105)和平均核苷酸差異(K=3.2)也相對較高。居群Pop1、Pop5、Pop8、Pop9具有單一的一種單倍型，核苷酸多態性和單倍型多態性均為0。

由單倍型分布可以看出，15種單倍型中只有H5被居群Pop3和Pop7共享，H7被居群Pop2、Pop4、Pop7共享，其他的單倍型都是地域特異性地分布在一個地點的群體中，為各居群所特有，說明各居群較為獨立，可能存在潛在的質粒水平的隔離[27]。

表5 基于合并序列9個羊草居群的遺傳多樣性和單倍型多樣性分析Table 5 The genetic diversity and haplotype diversity analysis of different populations in L. chinensis based on combined sequence

2.4 基于合并序列的不同羊草居群遺傳變異分析

通過AMOVA 分析可知，羊草居群65%的遺傳變異存在于群體間，35%存在于群體內(表6，P<0.01)，居群間遺傳變異大于居群內；遺傳分化系數Fst=0.58884，說明羊草居群間存在較大的遺傳分化，居群間變異是羊草的主要變異來源。根據基因流(Nm)與Fst之間的關系：Nm=(1-Fst)/4Fst[28]，得到Nm為0.17，基因流較小。

表6 基于合并序列羊草居群內與居群間的分子變異分析Table 6 AMOVA for different populations in L. chinensis based on combined sequence

羊草各居群間的遺傳距離較小，居群Pop3 和Pop8、Pop8和Pop9遺傳距離達到最大,為0.002，其他各居群之間多為0.001(表7)。居群之間的遺傳分化指數表明，居群Pop3和Pop7沒有表現出遺傳分化(-0.093)，居群Pop2和Pop6(0.214)、Pop3和Pop6(0.154)、Pop4和 Pop7(0.178)、Pop6和 Pop7(0.170)遺傳分化較大，其他各居群之間均為高度分化[29](表7)，同時較小的基因流(0.17)也加劇了居群之間的遺傳分化。

PERMUT軟件分析結果顯示，羊草所選分布區居群內的平均遺傳多樣性Hs為0.732(0.1401)，居群間總遺傳多樣性Ht為0.956(0.0253)，總的居群分化值Nst0.386(0.1865)大于Gst0.234(0.1506)，差異顯著(P<0.05)，表明羊草居群存在分子譜系地理結構；通過Mantel檢驗發現，各居群之間的遺傳距離與地理距離存在顯著相關性(r=0.449，P<0.05)。

表7 基于合并序列不同羊草居群的遺傳距離和遺傳分化指數Table 7 Genetic distance and pairwise fixation indices of genetic variation of different populations in L. chinensis based on combined sequence

注：遺傳距離(對角線下方)；遺傳分化指數(Fst，對角線上方)。

Note: Genetic distance (below diagonal) ; pairwise fixation indices of genetic variation (above diagonal).

2.5 基于合并序列不同單倍型羊草的系統發育分析

圖1 基于合并序列不同羊草居群的系統發育NJ樹Fig.1 NJ tree of different populations based on combined sequence

基于鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構建羊草不同單倍型之間的系統發育樹(圖1)。所選37個羊草個體15個單倍型分為兩大分支，其中單倍型H2和H10聚為一大分支，H3和其余單倍型為另一分支；除H2、H10和H3以外的單倍型又分為3小分支，H5、H8和H13聚為一支，H9單獨聚為一支，其余聚為另一支，其中H4和H6、H11和H12的居群親緣關系較近，各聚為一支。

2.6 基于合并序列羊草的單倍型網絡圖分析

運用中介鄰接網絡(Median-Joining network，MJ)算法，構建羊草不同地理位置種質cpDNA單倍型間的關聯圖(圖2)。單倍型和中介矢量載體的名稱分別表示為H-和mv。單倍型H3位于分支的軀干上，通過mv1和mv2將H2和H10、H2和H3連接起來。H2和H3、H3和H10的居群親緣關系較遠；H11和H12、H4和H6的居群親緣關系較近，與H1、H14和H15聚在H7節點上；H8、H13與H5的親緣關系較近；H5、H7和H9共同聚在H3節點上，親緣關系較近(圖2)；這與系統發育樹分析結果基本一致。

3 討論

3.1 羊草葉綠體非編碼區的多態性標記

牧草葉綠體基因組大小一般為120～170 kb，基因組通常包括120～130個基因，其基因容量和基因順序非常保守[28]。本研究羊草葉綠體基因組12條非編碼區片段共檢測到40個變異位點，其中插入/缺失變異位點12個占總變異的30%。有研究發現葉綠體基因組核苷酸變異中替換約占70%，插缺突變約占30%，或替換發生的頻率是插缺變異發生頻率的3倍[30]，本研究所得的結果與前人研究大致相同。目前對插入/缺失產生的機制和過程還不是十分清楚，插入/缺失變異的產生過程比核苷酸替代要復雜很多，由于測序產生的誤差和基因組信息的不全，導致插入/缺失突變很難被準確地檢測出來[31]，故插缺變異的統計可能存在誤差。

圖2 基于合并序列的單倍型網絡圖Fig.2 The network for cpDNA haplotype based on combined sequence 圓圈面積大小與單倍型頻率呈正比，同一單倍型圓圈中的不同顏色代表不同的群體，mv1和mv2表示假定的單倍型節點。The area of the circle is proportional to the frequency of haplotype; the colors in the same circle represent different populations.

12條葉綠體非編碼區片段在所選羊草材料上檢測到不同程度的變異，可能是由各片段進化速率不同導致的[23]。其中序列ndhF-rpl32、trnL-trnF、trnC-ycf6、aptI-aptH變異相對較豐富，在羊草中的進化速度相對較快，是低水平分子研究較好的選擇[32]，這與前人的研究結果基本一致[17,19]?；騨dhF-rpl32序列位于小單拷貝SSC區，有相對較豐富的變異位點，檢測到5處簡約性信息位點，推測其豐富的變異可能是因為在葉綠體基因組DNA復制過程中小單拷貝區的位置較易引入突變。psbA-matK、rpl20-rpl12、trnS-trnG、atpB-rbcL、trnF-ndhJ序列檢測到的信息位點較少，而劉靜等[33]利用葉綠體基因間隔區atpB-rbcL序列對小麥族不同屬的植物進行序列變異分析，檢測到了較多的簡約性信息位點，約占2.5%。本研究的結果與之不同，原因可能是不同序列片段在不同類群的物種中得到的變異情況不同，這幾個序列片段進化速率在羊草中相對較慢。

3.2 羊草的群體遺傳多樣性

一般來說，物種遺傳多樣性受其生存環境、自然進化和本身適應能力等因素影響。通過對9個不同地理分布羊草居群的遺傳多樣性進行分析，共鑒別出15種單倍型，羊草總體上呈現出較低的遺傳多態性(Hd=0.928，Pi=0.00101)；Nm值(0.17)小于1，表明羊草各居群的基因交流較小。生殖方式為異交的物種遺傳多樣性一般小于等于0.1，羊草居群的核苷酸多態性指數(Pi)僅為0.00101，遠低于0.1，可能是因為羊草為克隆植物，主要通過無性系繁殖，有性生殖能力低下。中性檢驗Tajima’sD值和Fu’sFs值均為負值，在P>0.10水平上不顯著，說明羊草在進化的過程中遵循中性進化模式，可能經歷過種群擴張，導致其遺傳多樣性較低[34]。羊草單倍型多態性和核苷酸多態性在每個種群間表現不同，推測可能是由于羊草分布范圍較為廣泛，各種群所處自然環境條件不同，經過生態選擇、自然選擇導致不同地理種群羊草的遺傳多樣性有所不同。劉惠芬等[35]對來自內蒙古草原不同生境8個羊草種群進行RAPD技術分析得到，較小地理范圍內羊草的遺傳分化程度較小，其遺傳分化主要是由環境的異質性所引起，與其生境間的相似度相關。任文偉等[36]也得到羊草的變異和分化是多種生態因子綜合作用的結果(如溫度、海拔、經緯度、土壤類型等)，錢吉等[37]發現水分是影響羊草種群間遺傳變異和生態型分化的最主要的因子，環境差異是引起羊草遺傳變異的主要因素。本研究種群Pop3位于山西運城市，是地處黃土高原的山地，種群Pop7位于內蒙古自治區通遼市，地貌類型以沙丘、沙地為主要特征，Pop3、Pop7種群的遺傳多樣性水平最豐富，可能與羊草不同地理種群的生活環境差異較大有關。

3.3 羊草的群體遺傳結構

植物居群的遺傳結構受群體進化歷史、基因流等影響，群體進化歷史一般通過遺傳分化指數(Fst)來反映，其大小可在一定程度上揭示種群間基因流和遺傳漂變的程度[38]。一般來講，當Fst<0.05，群體間沒有遺傳分化；0.050.25，群體間分化程度非常高[29]。羊草居群遺傳分化指數(Fst)為0.58884，說明群體間遺傳變異較大，分化程度較高。羊草為兼性生殖植物，有一定異交生殖能力，本研究所選羊草材料地理距離較遠，發生基因交流的可能性較小，這也加劇居群間遺傳分化的增大；各居群所處環境的不同，也是產生居群間遺傳變異的原因。AMOVA分析顯示羊草分子變異主要表現在居群間(65%)，且達到了顯著差異(P<0.01)，這與前人研究結果不同。Gong等[39]和Wang等[40]分別使用AFLP、RAPD分子標記對羊草進行遺傳變異分析，均得到主要變異是發生在種群內。葉綠體DNA比核DNA序列相對保守，變異速率僅次于核基因組。另外，使用多個葉綠體分子標記相聯合進行分析的方法比使用單一分子標記所能提供的有效信息更為全面可靠[41]。本研究選取4個遺傳變異相對豐富的葉綠體分子標記進行遺傳變異分析，提高了遺傳多樣性檢測的靈敏度，更加客觀地反映了羊草各地理居群的遺傳結構。

4 結論

本研究從羊草12條葉綠體非編碼區中篩選出ndhF-rpl32、trnL-trnF、trnC-ycf6、aptI-aptH4條序列變異相對較高，可作為下一步探討羊草野生群體譜系地理關系與進化歷程理想的分子標記；羊草遺傳多樣性水平較低(Hd=0.928，Pi=0.00101)，基因流較小(Nm=0.17)，遺傳分化程度較高(Fst=0.58884)，遵循中性進化理論，可能經歷過種群擴張；各居群遺傳距離與地理距離相關性顯著，存在分子譜系地理結構。