蘇木對糖尿病大鼠血管內皮細胞自噬相關蛋白表達的影響※

佟曉哲劉 婷

（1 錦州醫科大學附屬第一醫院中醫針灸科，遼寧 錦州 121000；2 錦州醫科大學碩士研究生2014級，遼寧 錦州 121000）

糖尿病的大血管并發癥包含糖尿病冠心病、糖尿病下肢動脈硬化閉塞癥等，它有較高的致殘率和死亡率。動脈粥樣硬化在胰島素抵抗、血脂異常等因素的作用下，出現血管內皮損傷、血管平滑肌細胞異常增殖，其斑塊進展與斑塊區內皮細胞的增殖程度與脂質浸潤程度呈正相關[1]。高糖誘導“內皮損傷學說”是糖尿病血管并發癥發生的關鍵[2-4]。嚴重的內皮損傷，細胞的凋亡及壞死性細胞死亡，使得細胞間隙增大，血液中脂質及炎癥細胞等更易進入內皮組織，加速動脈粥樣硬化的進程。因此保護血管內皮，對防治糖尿病血管并發癥具有重要理論意義。

自噬是細胞將受損變性的蛋白質以及損傷細胞器運輸到溶酶體進行消化降解，以實現細胞本身代謝的需要和相關細胞器的更新，并且以胞質內出現自噬體為特征的細胞自我消化過程，是細胞在應激情況下用來維持內環境穩定和存活的重要機制。在動脈粥樣硬化中，自噬對血管內皮細胞及平滑肌細胞起到了保護的作用[5]。中醫認為，糖尿病大血管并發癥相當于“血痹”“脈痹”“脫疽”等疾病，其病機為瘀血阻滯。蘇木為豆科云實屬植物，性味咸、甘、平，有活血化瘀、消腫定痛的作用。我們前期試驗已證實蘇木對糖尿病大鼠下肢血管病變有改善作用[6]，現探討其調控自噬，對糖尿病大鼠血管內皮的保護作用。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 中藥蘇木“全成分”免煎顆粒，北京康仁堂藥業有限公司，按照“全成分”免煎顆粒的換算標準算得相應濃度，高溫蒸餾水溶化（批號15018601，符合國家規定的藥物質量標準），濃度為810 mg/kg生藥量大鼠體重。

1.2 動物 6～8周齡SD大鼠，雄性，SPF級，體質量（200±20） g，北京維通利華實驗動物有限公司（合格證號SCXK(京)2012-0001）。

1.3 試劑 鏈脲佐菌素（STZ），Sigma美國，濃度為30 mg/kg大鼠體重；兔抗BECN1抗體、兔抗p62多克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司；兔抗LC3多克隆抗體，CST公司；飼料配方：①高脂高糖飼料：蔗糖20%，豬油20%，膽固醇2.5%，基礎飼料57.5%。②高脂飼料成分：基礎飼料88%、膽固醇2%、豬油10%。1.4儀器 光學顯微鏡（OLYMPUS日本）；超高速離心機（Sigma）；透射電鏡 (日本日立公司 H-7650)；酶標儀（Bio-Rad Mycycler）；蛋白電泳儀（Bio-Rad 164-5052）；凝膠成像儀（Bio-Rad）；血糖分析儀（美國強生）。

1.5 方法 30只健康雄性SD大鼠，飼養于錦州醫科大學SPF級動物房。飼養1周后，按隨機數字表法隨機分為正常組10只。其余20只大鼠給予高脂高糖飼料喂養4周后，按150 mg/10 mL/kgSTZ尾靜脈注射，3 d后斷尾取血測血糖，以3次隨機血糖≥16.7 mmol/L作為糖尿病大鼠模型成模標準，造模成功后繼續高脂飼料喂養。將造模成功的大鼠再隨機分為造模組與蘇木組，蘇木組按等效劑量810 mg/kg，每天灌服蘇木沖劑2 mL。其余灌服等劑量的生理鹽水。4周后全部處死取主動脈標本，生理鹽水沖洗，分別置于4%多聚甲醛、2.5%戊二醛固定液和-80℃冰箱中儲存備用。

1.5.1 記錄各組大鼠實驗前后一般狀況 記錄各組大鼠造模前（4周）、造模后72 h、取材前（8周）的血糖。

1.5.2 HE染色觀察糖尿病大鼠主動脈形態結構 將固定于4%多聚甲醛的大鼠主動脈常規脫水，石蠟包埋，蠟塊切片約厚4 μm，脫蠟，蘇木精-伊紅（HE） 染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.3 透射電鏡觀察糖尿病大鼠內皮細胞中的自噬結構 將固定于2.5%戊二醛的大鼠主動脈再經鋨酸固定，乙醇丙酮脫水，環氧樹脂包埋，切片后醋酸鈉、檸檬酸鉛雙重染色，日本日立公司H-7650透射電鏡觀察并攝片。1.5.4 Western-blot檢測BECN1、LC3-Ⅱ、p62 的蛋白表達 超聲震蕩大鼠主動脈組織，提取蛋白，定量后煮沸5 min變性，半干轉膜法將蛋白條帶轉至PVDF膜。常溫封閉2 h，TBST洗膜，一抗工作液Beclin1（1∶500）、LC3-Ⅱ （1∶1000）、p62（1∶500) 孵育 4 ℃過夜，TBST洗膜，常溫孵育二抗1 h，TBST洗膜，顯影并分析各條帶灰度。

1.6 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件，計量資料用（x±s）表示，行t檢驗。

2 結果

2.1 一般狀況 糖尿病造模成功的共有18只，再隨機將18只糖尿病大鼠分為模型組（n=9） 和蘇木組（n=9）。造模后，大鼠出現多飲、多食、多尿。取材前，造模組大鼠體重較正常組減低。各組血糖變化見表1。

表1 各組大鼠血糖變化 （x±s，mmol/l）

2.2 HE染色觀察糖尿病大鼠主動脈形態結構 正常組大鼠主動脈血管組織HE染色血管內膜平整、光滑，呈波紋狀，未見內皮細胞腫脹及明顯破壞現象，平滑肌呈規則層狀排列，SMC呈長梭形，無萎縮變薄，無增厚；模型組見血管內膜缺損，內皮細胞損傷，平滑肌細胞增生，排列紊亂，彈力板有斷裂現象，厚薄不均呈交織狀，偶可見大量泡沫細胞等；蘇木組內膜內皮細胞雖有破壞，但較造模組有改善，平滑肌尚規則排列，但仍有少許位置厚薄不均，未見泡沫細胞（圖1）。

圖1 顯微鏡下各組大鼠主動脈形態結構

2.3 透射電鏡觀察糖尿病大鼠內皮細胞中的自噬結構自噬泡以胞漿內形成具有雙層膜的結構為特點，內部包裹線粒體樣細胞器。模型組糖尿病大鼠血管中的自噬體數量減少，蘇木組的細胞中自噬體數量增多，說明蘇木能促進血管內皮細胞的自噬活性，并能拮抗高糖對血管內皮細胞自噬活性的抑制作用（圖2）。

圖2 透射電鏡下各組大鼠內皮細胞中自噬體

2.4 Western-blot檢測 BECN1、LC3-Ⅱ、p62 的蛋白表達 使用凝膠電泳成像系統，對蛋白條帶進行分析，與正常組比較，模型組和蘇木組BECN1、LC3-Ⅱ的蛋白表達均降低。與模型組比較，蘇木組BECN1、LC3-Ⅱ蛋白表達增高。與模型組比較，蘇木組p62蛋白表達降低 （P＜0.05）。見圖3、表2。

圖3 各組大鼠BECN1、LC3-Ⅱ、p62蛋白表達

表2 各組大鼠BECN1、LC3-Ⅱ、p62蛋白表達 （x±s）

3 討論

未來10年，國際糖尿病聯盟（IDF）估計全球將有近5億糖尿病患者，高糖引起的血管內皮細胞損傷是糖尿病大血管并發癥發生的病理基礎，因此保護糖尿病的血管內皮損傷是防治血管并發癥的首選策略。糖尿病大血管病變的病機是疾病日久，陰虛內熱，灼傷營血，血行不暢，加之飲食不節，脾失健運，痰濁瘀血阻滯脈絡而致。在臨床治療中多選用活血化瘀的中藥來治療。以前的實驗已證明蘇木能夠改善糖尿病下肢血管病變的缺血區的血供。本實驗中，通過HE染色觀察高糖造成了大鼠主動脈血管內皮的損傷，蘇木組的血管內皮細胞雖有破壞，但較模型組已有明顯改善，平滑肌也較為規則排列，但仍有少許位置厚薄不均，未見泡沫細胞。證明活血化瘀中藥蘇木能夠保護糖尿病的大血管病變。

自噬被認為是細胞在壓力條件下的適應機制。透射電鏡觀察自噬體是目前公認檢測自噬的金標準，自噬泡以胞漿內形成具有雙層膜的結構為特點，內部包裹線粒體樣細胞器。透射電鏡下，造模組主動脈內皮細胞中自噬體數量減少，蘇木組的自噬體數量增多，證明蘇木能促進血管內皮細胞的自噬活性。BECN1是自噬體形成過程中所必需的分子，可介導自噬蛋白定位于吞噬泡，繼而調控自噬體的形成與成熟；脂溶形式的LC3-Ⅱ結合在自噬體膜上，促進自噬體與溶酶體融合，LC3-Ⅱ是細胞內自噬的標記物。實驗結果顯示蘇木組BECN1、LC3-Ⅱ的蛋白表達增加，與自噬呈正相關。p62蛋白參與細胞自噬，維持細胞內穩態和信號傳導。自噬缺陷可導致p62綁定的蛋白聚集。有研究還表明p62蛋白有糖尿病相關，p62蛋白能增加小鼠的體重和脂肪，并有多器官的胰島素抵抗，并可通過自噬和mTOR的作用調節脂肪的形成。蘇木組的p62蛋白表達下降，與自噬呈負相關。因此，蘇木可能通過調控自噬相關蛋白BECN1、LC3-Ⅱ、p62的表達來保護血管內皮損傷。