神經營養因子-3聯合全反式維甲酸與β-巰基乙醇誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化效果比較

張杰，秦華麗，蔣明

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，浙江 溫州 325015；2.長沙市婦幼保健院 耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 長沙 410007；3.中南大學湘雅三醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 長沙 410013）

近年來骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）治療神經退行性病變日益受到學者重視。BMSCs具有高度自我復制能力和多向分化潛能，且在適宜條件下能向神經元樣細胞分化[1]。目前最常見的誘導劑為神經營養因子與化學制劑。本研究比較堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）預誘導后，再用神經營養因子-3（neurotrophin-3，NT-3）聯合全反式維甲酸（retinoic acid，RA）與β-巰基乙醇（beta-mercaptoethanol，β-BME）進行分步誘導的方法來體外誘導BMSCs向神經元樣細胞分化的效果差異。

1 材料和方法

1.1 材料 澳洲胎牛血清、0.25%胰酶-0.02%EDTA、青鏈霉素購自美國Gibco公司；PE anti-rat CD29、CD90、CD45、IgG1購自美國BioLegend公司；β-BME、bFGF、RA、NT-3購自美國PeProtech公司；Cy3標記山羊抗兔IgG（H+L）購自上海碧云天公司；L-DMEM培養基購自美國Hyclone公司；大鼠抗山羊神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific endase，NSE）購自武漢博士德公司；4～6周齡，40～60 g雄性SD大鼠購自中南大學湘雅三醫院動物實驗中心，動物許可證號為SYXK（湘）2014-0013。

1.2 方法

1.2.1 分離培養大鼠BMSCs：用腹腔注射水合氯醛麻醉后，無菌條件下取大鼠股骨和脛骨，用2 mL注射器抽取含10%胎牛血清的DMEM培養基反復沖洗骨髓，離心去上清，以1×105個/mL的細胞密度接種于25 cm2細胞透氣培養瓶內，置于飽和CO2，濕度5%，37 ℃恒溫培養箱內培養。按照8 h首次換液，后3 d換液1次的方法，待細胞長滿后傳代。每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。

1.2.2 BMSCs表面標記分子的鑒定：待P3代BMSCs長滿瓶底90%以上時，胰酶消化后移入15 mL離心管內，1 000 r/min，離心5 min，PBS重懸細胞，重復3次，調節細胞密度到1×106個/mL，分別加入抗體試劑PE-CD29、PE-CD90、PE-CD45各3管，及1管PEIgG1，置冰上避光孵育30 min。4 ℃，2 000 r/min，離心5 min，棄上清，PBS重懸，重復3次，洗凈未結合的抗體。每管加入200 μL PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測，重復3次，CELLQUEST軟件分析結果。

1.2.3 體外誘導BMSCs向神經元樣細胞分化：取P3代BMSCs胰酶消化后，按8×103個/mL的密度接種于預先放有消毒蓋玻片的6孔板內制備細胞爬片，加完全培養液2 mL，待細胞60%～70%融合。用預誘導液2 mL（98% L-DMEM+2% FBS+10 ng/mL bFGF[2]）誘導24 h后，隨機分為A組（NT-3+RA，換用98% LDMEM+2% FBS+20 ng/mL NT-3+0.5 μmol/L RA[3]）和B組（β-BME，換用98% L-DMEM+2% FBS+1 mmol/L β-BME[3]），2組各用2 mL誘導劑誘導1 h、5 h、24 h、7 d、14 d、21 d后于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。

1.2.4 細胞免疫熒光鑒定：取細胞爬片用PBS洗3次，5 min/次，再用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，5 min/次，再用0.5% Triton-X100浸泡打孔15 min，PBS洗2次，5 min/次，后用封閉液封閉，4 ℃冰箱過夜。加已用封閉液稀釋的一抗200 μL，37 ℃避光孵育3 h。用含0.1% Triton-X100的PBS漂洗4次，5 min/次。加入已用PBS稀釋的二抗200 μL，37 ℃避光孵育1 h。用含0.1% Triton-X100的PBS漂洗4次，5 min/次。用ddH2O按1∶2 000稀釋的DAPI，避光染色5 min；PBS漂洗4次，5 min/次，甘油封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。隨機選擇10個非重疊視野，分別計算誘導后1 h、5 h、24 h、7 d、14 d、21 d的NSE陽性率（NSE染色陽性率=陽性細胞數/總細胞數）。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS13.0軟件進行統計學分析。正態分布計量資料用表示，同組內不同時間點比較用單因素重復測量方差分析，相同時間點2組間比較用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs原代培養和傳代培養結果 剛接種的BMSCs呈圓形，大部分懸浮在培養液中。各個時間段的BMSCs形態見圖1。

2.2 BMSCs表面標志物鑒定結果 由流式細胞儀檢測，CD45 PE陽性率分別為8.34%、6.95%、6.94%，平均7.41%；CD90 PE陽性率分別為99.98%、99.98%、99.98%，平均99.98%；CD29 PE陽性率分別為98.21%、98.32%、97.20%，平均97.91%；故CD29 PE、CD90 PE為陽性表達，CD45 PE為陰性表達。見圖2。

圖1 BMSCs原代培養和傳代培養結果（×100）

圖2 BMSCs表面標志物流式鑒定結果

2.3 BMSCs誘導后細胞形態學變化 A組加NT-3+RA誘導1 h，少數胞體有軸突樣改變，見圖3A；誘導5 h細胞漩渦樣生長，部分胞體軸突明顯延伸，較前增多，并出現少許多角形細胞，見圖3B；誘導24 h細胞數量增多，出現少許胞體變圓的細胞，見圖3C；誘導至7 d大多數細胞胞體變圓，可有雙觸角或多觸角細胞，可呈多角形，內可見2～3個核仁。胞間漩渦狀趨勢逐漸消失，部分細胞間相互連接交織成橋梁狀，見圖3D；誘導至14 d細胞突起較前明顯延長，并出現一、二級分支，形成雙級或多極的突起，突起間互相連接，呈網絡狀，見圖3E；誘導21 d，仍可見少許存活的神經元樣細胞，其連接的突起變細，細胞橋梁趨向斷離，其中部分細胞出現顆粒及空泡，呈死亡趨勢，見圖3F。B組加β-BME誘導1 h，部分胞體呈短棒形或圓形，見圖4A；5 h時見胞體可呈雙觸角或多觸角樣改變，有些亦見雙核仁，部分細胞胞質中出現顆粒和空泡，見圖4B；24 h時見懸浮的細胞碎片增多，大部分細胞胞體破裂，趨向老化死亡，見圖4C。

圖3 BMSCs經NT-3+RA誘導后各時間點細胞形態學變化（×100）

2.4 2組BMSCs的NSE表達情況比較 免疫熒光結果示，A組誘導分化24 h和B組誘導分化5 h后NSE均陽性表達，見圖5。

圖4 BMSCs經β-BME誘導后細胞學形態變化（×100）

圖5 2組NSE免疫熒光鑒定結果（×200）

B組在誘導24 h后大部分細胞死亡。經統計學分析，A組誘導分化7 d后達到高峰，NSE表達率為（81.92±5.02）%，與其他時間點比較差異有統計學意義（P＜0.01）。B組誘導5 h后NSE表達最高，與1 h比較差異有統計學意義（P＜0.01）。在1 h和5 h B組NSE表達率高于A組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

3 討論

BMSCs起源于中胚層組織，是一種具有多分化潛能的非造血干細胞，在一定條件下可以被誘導分化為外胚層起源的神經元樣細胞。已有研究發現BMSCs分化的神經元樣細胞能修復受損的神經[4]，并且移植后能為自身修復提供支架[5]，因此BMSCs可以作為治療神經退行性疾病的理想種子細胞。

隨著研究的不斷深入，研究者發現了很多種BMSCs向神經元樣細胞分化的誘導劑，主要有：RA、抗氧化劑（β-BME[3]、褪黑素、丁羥茴醚、二甲亞砜等）、神經營養因子及生長因子[3]（NT-3和bFGF）、中藥[6]等。但其誘導機制仍然不明確。其中，RA能催化胚胎干細胞定向誘導分化為神經元，能調控細胞的生長增殖及分化，有很強的誘導劑功能[7]，能和生長因子聯合，增加神經細胞的合成[8]。β-BME為強抗氧化劑，可以通過提高胞內cAMP水平[9]，進一步誘導BMSCs轉變成神經細胞樣形態。bFGF是一種具有多種功能的多肽生長因子，可以促使BMSCs向神經元樣細胞分化[1]，參與分化啟動，細胞的生長、發育和組織損傷的修復[10]，可能與wnt信號通路相關[11]。而NT-3作為神經營養素家族中的一員，在誘導BMSCs向神經元樣細胞轉化過程中非常重要[12]。

為了尋找BMSCs的最佳誘導方案，獲得更佳的誘導結果，研究者采用了各種研究方案去提高誘導率，但是不同的誘導劑，其轉化效率大為不同，如：FGF-RA方案[13]陽性分化率約為40%，而BME-RA方案[14]的分化率約為20%。而且不同研究者可能因操作手法的差別，即使采用相同的方法也可能得出不同的誘導率[15]。此外，DEZAWA等[16]的研究表明聯合誘導分化高于單獨誘導分化，HERMANN等[17]的研究結果則證實分步誘導優于單一步驟誘導，且能夠獲得較高的分化效率。

表1 BMSCs誘導分化成神經元樣細胞NSE陽性表達率（，%）

表1 BMSCs誘導分化成神經元樣細胞NSE陽性表達率（，%）

與同組內其他時間點比：aP＜0.01；與A組同時間點比：bP＜0.01

組別 n 1 h 5 h 24 h 7 d 14 d 21 d A組 3 1.60±0.44 5.53±1.21 18.55±0.55 81.92±5.02a 68.98±2.41 15.72±1.90 B組 3 6.09±0.76b 15.41±2.11ab — — — —

劉謙虛[18]的研究認為RA誘導穩定表達腦源性神經營養因子的BMSCs表達NSE陽性率高于單獨的RA誘導，且單用RA與不加誘導劑的空白對照組無明顯變化，故本研究采取分步誘導+聯合誘導，bFGF預誘導24 h后，再換用NT-3+RA及β-BME誘導，探索相對較好的誘導方案。結果發現2組均能誘導BMSCs向神經元樣細胞分化，但是NT-3+RA組細胞存活時間較β-BME組顯著延長，故后期誘導分化率較β-BME組高，但β-BME組短期誘導分化率較高。這些結果與前人研究基本一致。有學者認為[19]化學藥物可導致BMSCs的肌動蛋白網絡斷裂，并引起細胞質回縮，可有似神經元細胞樣伸出軸突的假象，這也可能是β-BME誘導后細胞生存時間短的原因。而NT-3+RA組細胞存活時間長，而且后期分化率高，可能與NT-3的神經營養作用有關。故NT-3+RA方案較β-BME方案更佳。但考慮到誘導劑還存在可能的致畸性[3]，而且移植的細胞在中樞神經系統存活時間較短暫[15]，故誘導的BMSCs能否通過移植來治療神經退化性疾病仍需進一步實驗來證實。