花多多對金線蓮組培苗和移栽成活率的影響

牛 歡，謝卓宓，古 力，梁 瑩，韋坤華，繆劍華，李明杰,3，張重義,3*

(1.福建農林大學 作物科學學院，福建 福州 350002；2.廣西壯族自治區 藥用植物園，廣西 南寧 530023；3.福建農林大學 作物遺傳育種與綜合利用省部共建教育部重點實驗室，福建 福州 350002)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii)又名金線蘭、金蠶、烏人參、金線入骨消等，是一種多年生蘭科草本植物[1]。主產于中國、印度等幾個亞洲國家，國內金線蓮主要在福建、云南等地種植。金線蓮含多糖、黃酮類化合物、生物堿等多種成分，具有抗衰老、提高機體免疫等功效[2]。但由于金線蓮對生長環境要求嚴格，種子缺乏胚乳、自然條件下發芽率極低，導致種質資源匱乏。目前，生產上金線蓮多采用組織培養的方法進行繁育[3]。雖然金線蓮的組培技術也相對較為成熟，但從組培苗移栽到大田環境下，組培苗的質量和煉苗環節仍然是影響最終成活率的關鍵因素。這使得具有優良基礎的金線蓮組培苗成了決定其成活率以及煉苗有效性的前提條件。為了獲取金線蓮林下移栽所需要的最佳長勢組培苗，本研究立足前期金線蓮繁育和栽培體系基礎，外源添加蘭科通用肥料花多多1號、11號，研究不同外源添加物水平對金線蓮組培苗生長狀況、多糖含量、可溶性蛋白含量與移栽成活率的影響。本研究不僅為金線蓮進行煉苗和后期移栽提供優良的材料，也為提高金線蓮的安全生產和有效性奠定重要組培技術支撐。

1 材料與處理

1.1 試驗材料

以福建省廣泛種植的金線蓮品種“泰寧一號”為試驗材料，在福建農林大學中藥材GAP研究所內，將MS、B5培養基作為基礎，詳細研究不同外源添加肥料對金線蓮組培苗的影響，以獲取能夠在林下或大棚成活率高且有效的組培苗。

1.2 試驗處理

基于課題組前期已經構建的金線蓮繁殖體系[4]的研究基礎，以MS/B5+瓊脂7 g/L+蔗糖25 g/L+NAA 0.2 mg/L+活性炭1.5 g/L作為基礎培養體系。分別添加0、1、2、3 g等不同水平的蘭科專用肥(花多多11號)和普用肥(花多多1號)。選擇長勢一致的金線蓮增殖苗，以莖段接種方式接種到相應培養基上[5]，每瓶接種15叢，每個處理接種10瓶，每個處理3組重復。培養條件設置為溫度25 ℃左右，光照強度750～1500 lx，光照時長10～12 h/d[6]。接種150 d后移出培養基，對其生理生化指標進行測定，并在每個處理中選取長勢相對一致的種苗進行林下移栽，移栽30 d后統計各處理成活率，最終獲取林下移栽所需的最佳處理。

2 試驗方法

2.1 生物量測定

在接種后150 d進行取樣，統計金線蓮植株莖高與莖粗、葉片長寬、根長與根粗、鮮重與干重，并計算其折干率。

2.2 多糖含量測定

接種后150 d對移出的組培苗進行多糖含量的測定，并根據蒽酮-硫酸比色法測定多糖含量[7]。取金線蓮全株，在40 ℃的真空干燥箱內烘干1 h，將植株取出后研磨成細粉狀，經380 μm孔徑篩進行過濾；60 ℃水浴，超聲振蕩提取40 min；在4200 r/min轉速下離心15 min后取上清液。將所獲取的沉淀加水，重復離心2次，合并3次上清液，將其低溫旋轉蒸發至10 mL。移取3 mL提取液加入蒽酮試劑反應，進行沸水浴加熱后迅速移入冷水浴冷卻，在625 nm下測定A(吸收度)值。根據試驗中建立的葡萄糖標準曲線回歸方程：y=0.0495x-0.0059(R2=0.9911)計算多糖含量。

2.3 可溶性蛋白測定

采用考馬斯亮藍法[8]測定總蛋白含量，稱取各處理鮮樣0.5 g，將研缽置于冰浴中研磨，添加4次0.05 mol/L pH=7.8磷酸緩沖液，第一次添加1.5 mL，其余3次添加1 mL，研磨成漿后移入離心管，于4 ℃、14000 r/min條件下離心15 min，取上清液為待測蛋白。采用考馬斯亮藍G-250比色法測定，以牛血清蛋白作為標準蛋白。使用分光光度計在595 nm下比色測定可溶性蛋白含量。按照以下公式計算出可溶性蛋白含量[9]。

其中，C為按照標準曲線得出的蛋白含量，V為提取蛋白的提取液體積，D為溶液稀釋倍數，M為研磨用的鮮樣品質量，Vt為測定時取用的待測液的體積。

2.4 數據處理

用Excel對不同處理的數據進行初步整理，用DPS軟件對不同處理的數據進行統計分析[10]。

3 結果與分析

3.1 培養基內外源添加肥料對金線蓮生長狀況的影響

以普通MS和B5培養基作為基礎培養基，分別添加不同水平的花多多1號與花多多11號，研究其對金線蓮組培苗生長的影響。從2種培養基總體上來看，B5+添加物的培養基能夠顯著促進金線蓮組培苗根數量增加。在2種培養基中分別加入不同水平的花多多均能夠促進根數增加，但對根長的影響相對較小。同時，B5+花多多1號的效應顯著優于B5+花多多11號。值得注意的是，B5加2～3 g花多多11號的處理之間效果無顯著差異。因此，在生長過程中如果想獲取根系較多的組培苗，可以用B5培養基加入適量花多多1號誘發苗體產生更多根系。根據表1可以發現，B5+3 g花多多1號培養基內金線蓮根數量的增長情況更加明顯；但對于平均根長的影響，MS培養基優于B5培養基，MS+2 g花多多1號培養基內平均根長增加更為明顯，并且其生根數與B5+3 g花多多1號處理相比，在0.01水平上無顯著差異性。綜合根長與根數來看，MS+2 g花多多1號培養基內金線蓮根系生長狀況最好，最適合移栽。

根據表2所示，金線蓮莖長與莖粗的增加以MS+2 g花多多1號培養基內效果更為顯著。MS+3 g花多多1號培養基與B5+2 g花多多11號培養基內金線蓮葉片寬度與其他處理有明顯差異，其葉片寬度明顯大于其他處理下的葉片寬度。對于葉片長度，B5+2 g花多多11號培養基內金線蓮葉片長度明顯大于其他處理。綜合葉寬與葉長，以B5培養基為基礎時添加2 g花多多11號對金線蓮葉片生長最有利。總體而言，以MS為基礎培養基添加花多多1號的培養基中，金線蓮組培苗在莖長、莖粗等生長指標明顯優于其它處理；在以B5為基礎培養基的條件下添加花多多11號金線蓮的葉片生長狀況較好。

培養基中添加外源添加物對組培苗莖、葉的影響與對根系生長的影響相反。從2種培養基的本底來看，MS培養基更有利于根、莖的生長，B5培養基更有利于葉片的生長。從不同添加物來看，花多多1號更有利于莖葉的生長。此外，從培養基和外源添加物的組合來看，MS+花多多1號相比其它處理能夠顯著促進根的生長和莖部的伸長和加粗。綜合不同處理對金線蓮組培苗根、莖、葉生長的影響可以看出，不同處理組合對根和莖、葉的生長影響存在著差異，這種差異更多是由于培養基本身性質所決定。因此，在金線蓮的生產實踐中，應該考慮不同培養基及添加物對苗體的影響，依據具體需求進行合理搭配以獲取理想的移栽壯苗。

表1 添加肥料對于金線蓮根系生長狀況的影響

注：表中小寫字母表示不同處理在P<0.05水平上的差異顯著性，大寫字母表示不同處理在P<0.01水平上差異顯著性。下表同。

表2 添加肥料對于金線蓮莖葉生長狀況的影響

3.2 外源添加物對金線蓮組培苗的生物量及移栽成活率的影響

各處理中以MS+2 g花多多11號處理的金線蓮組培苗平均折干率最高，達到26.53%，與其他處理呈現出明顯差異，表明以MS為基礎培養基添加2 g花多多11號能明顯增加金線蓮組培植株的干物質積累。在金線蓮生產上，大棚或林下環境中組培苗的移栽成活率對于金線蓮后期產量收獲具有重要意義。一般情況下影響金線蓮移栽成活率主要包括2個方面因素：一個是健壯金線蓮組培苗壯苗培育；另外一個是移栽馴化環節。本研究選擇闊葉林栽培不同處理培養基的組培苗，并對其移栽成活率進行觀察和記錄。結果發現在栽培30 d后，MS+2 g花多多1號培養基內的金線蓮組培苗成活率最高，達到83.12%，MS+0 g花多多成活率最低，只有70.77%。這表明適當的添加肥料可顯著提高金線蓮組培苗移栽成活率。

表3 不同培養基植株生物量積累及移栽成活率

3.3 不同外源添加物對金線蓮多糖及可溶性蛋白含量的影響

為了進一步了解不同外源添加物對組培苗的藥用活性成分影響。對不同培養基生長條件下金線蓮組培苗多糖及可溶性蛋白的含量進行測定。從測定結果可以看出，以B5+3 g花多多1號培養基上生長的金線蓮植株內可溶性蛋白含量最高，達到8.19 mg/g；以MS+2 g花多多11號培養基內的金線蓮多糖含量最高，達到23.51 mg/g。綜合以上結果得出，在MS和B5培養基內添加外源添加物能夠顯著提升金線蓮組培苗內多糖和蛋白含量。多糖和游離蛋白含量水平在一定程度上能夠反映出苗體的代謝水平和長勢。因此，本研究的結果說明金線蓮組培培養基內適當增添外源添加物能顯著提高組培苗的代謝水平。

圖a為多糖含量、圖b為可溶性蛋白含量；CK1、CK2代表兩個空白，A、B、C、D分別表示MS花多多1號、MS花多多11號、B5花多多1號、B5花多多11號，1、2、3代表添加花多多的質量1、2、3 g

圖1不同培養基添加物內金線蓮藥用活性成分含量

4 討論

將組培苗移栽到設施栽培和林下栽培環境中，組培苗的成活率是影響后期產量和品質的決定性因素之一。目前，在金線蓮組織培養的過程中，多采用在培養基中添加不同種類與用量的生長素[11]、碳源物質[12]等方法，以研究其對組培苗生長強弱和相應的壯苗效果的影響。前期的研究表明在金線蓮培養基中適當添加香蕉等外源添加物能顯著改善組培苗的長勢和長相[13]。花多多是重要的蘭科植物肥料，其中，花多多1號的基本配方為氮∶磷∶鉀=1∶1∶1[15]，加上世界專利的M-77微量元素組合使作物吸收養分更均衡，可以作為所有植物的通用肥料；花多多11號高鉀含量(N∶K=1∶5.2 )極大地滿足如蘭花這類具肉質根或假球莖植物對鉀肥的需求。研究發現花多多肥料能夠顯著促進植物的生長和發育[14]，添加于不同的培養基中能夠顯著改善組培苗的生長狀況。目前，在金線蓮培養基中添加肥料對金線蓮組培苗影響的研究相對較少。本研究通過添加不同水平2種肥料，詳細研究了適量花多多肥料對金線蓮組培苗品質的影響。結果發現：添加不同種類和不同量的肥料對金線蓮組培苗的長勢及營養成分均有不同程度的影響，并且發現金線蓮組培苗的長勢與營養成分含量無關，例如MS+2 g花多多1號處理下金線蓮組培苗長勢最好、移栽成活率最高,但其多糖成分僅有15.33 mg/g,可溶性蛋白含量為6.39 mg/g，均未達到最大含量；MS+2 g花多多11號處理下，雖然金線蓮生長狀況不佳，但其折干率與多糖含量最高。綜合來看，MS+2 g花多多1號處理下更利于培育壯苗、提高移栽成活率，同時，也可以看出花多多1號對于金線蓮的生長更有利。雖然本文具體研究了不同花多多添加水平對金線蓮組培苗的生長和長勢的影響，沒有系統結合金線蓮組培苗、后期設施和林下栽培技術體系進行系統研究，因此，后續還需進一步結合大田栽培進行深入研究。

致謝：感謝作物生態與分子生理學福建省高校重點實驗室(福建農林大學)對本研究的支持。