寬體金線蛭5個地理群體遺傳多樣性的RAPD分析及生長指標的比較研究

姜愛蘭，王信海，丁辰龍，吳學軍，唐金玉，王飛飛，葉建勇

(江蘇省農業科學院 宿遷農科所，江蘇 宿遷 223800)

寬體金線蛭(Whitmaniapigra)，隸屬于環節動物門(Annelida)有環帶亞門(Clitella)蛭綱(Hirudinea)真蛭亞綱(Euhirudinea)無吻蛭目(Arhynchobdellida)醫蛭形亞目(Hirudiniformes)黃蛭科(Haemopidae)金線蛭屬(Whitmania)，別名螞蟥、肉鉆子、水癡馬鱉[1]，是傳統的名貴中藥材，現代研究證明其涎液中含有一種由65～66種氨基酸組成的酸性低分子多肽、抗血凝物質，稱為水蛭素、肝素、抗血栓素等[2]，可治療中風、閉經、截癱、心絞痛、無名腫疼、腫瘤、頸淋巴結核等疾病，能使移植手術后的靜脈血管保持暢通，其蜂蜜浸出液亦可治療角膜潰病和角膜云翳，具有廣泛的藥用價值[3]。近年來，以水蛭為原料的藥品及保健品日漸增多，但由于各種天然水體中大量生活和工業污水的排入，農田中大量施用化肥和農藥，加上人為地酷漁濫捕，其種群數量急劇減少，自然資源日漸萎縮，幾乎很難形成產量，種質資源也受到嚴重破壞，從而導致其藥材及藥品價格不斷攀升，因此水蛭的人工養殖日趨受到重視[4]，也為漁民致富開辟了新的途徑。

目前，寬體金線蛭的研究工作大多集中在繁、養殖技術上[5-14]，對其種質資源狀況的研究還未見報道，為了解各個地理區域種群的遺傳背景和遺傳差異狀況以及遺傳差異與生長指標的相關性，本研究開展了不同地區寬體金線蛭遺傳差異性分析及生長指標的比較研究，以期為今后寬體金線蛭種質資源保護和遺傳育種及繁、養殖技術研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

寬體金線蛭親蛭和幼蛭于2016年3～5月分別從江蘇宿遷的駱馬湖(SQ)、江蘇興化的烏巾蕩(XH)、江蘇吳江的太湖(WJ)、湖北大悟縣的竹竿河(DWX)和黑龍江賓縣的松花江(BX)野外采集，活體運回試驗基地，置于掛在池塘內的60目網箱(規格：2.0 m×4.0 m×1.2 m)內暫養，暫養前1 d投放足量的活田螺，供親蛭、幼蛭暫養期間攝食。仔蛭來源于親蛭人工孵化后收集的幼蛭。

1.2 基因組DNA提取

采用CTAB法提取樣品基因組DNA。(1)在65 ℃水浴鍋中預熱 CTAB 提取液；(2)在液氮中迅速研磨樣品，將粉末狀材料轉入2 mL離心管中，加入預熱的CTAB提取液(每克樣品加入3～5 mL提取液)，65 ℃保溫30～60 min，每隔 10 min輕輕顛倒混勻；(3)11000 r/min條件下離心5 min，取上清轉入新離心管；(4)加入等體積酚/氯仿(1∶1)，充分混勻，11000 r/min離心10 min，取上清轉入新離心管；(5)加入等體積氯仿，充分混勻，11000 r/min離心10 min，取上清轉入新離心管；(6)重復步驟4、步驟5；(7)加入2/3體積的異丙醇混勻，室溫放置，沉淀 15 min；(8)11000 r/min條件下離心6 min，棄上清；(9)將沉淀用70%的乙醇漂洗一次，室溫條件下11000 r/min離心2 min，棄上清，重復洗一次；(10)提取產物2～3 μL用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余置于-20 ℃保存備用。

1.3 RAPD分析

1.3.1 RAPD 反應體系和擴增條件 PCR擴增體系(20 μL)為：DNA 模板 2 μL，primer 1 μL,藍色Mix 10 μL，去離子水7 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min，然后進行 40個循環：94 ℃變性30 s，36 ℃復性50 s，72 ℃延伸1.5 min；循環結束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3.2 RAPD 擴增產物的檢測 用30對引物對5個樣品進行PCR擴增，引物信息見表1，將PCR產物在2.0%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測。

1.4 生長試驗

分別測定仔蛭和幼蛭的生長指標。

仔蛭生長指標測定：分別從不同地理種群同一天孵出的仔蛭暫養槽內隨機取180條仔蛭分3組放于編好號的玻璃鋼水缸(尺寸：40 cm×50 cm×30 cm)中進行成活率統計和生長指標比較試驗，玻璃鋼水缸頂部用80目網片封住，水深10 cm左右，內部放2～3段PVC管，供幼稚棲息，每天換水2/3，投喂冰凍輪蟲和初孵豐年蟲。每隔5 d投喂殼寬3～5 mm左右的活的小田螺，每5 d從每缸內隨機取15條仔蛭稱重，21 d后取出全部稱重，計算平均體質量。

表1 RAPD引物信息

幼蛭生長指標測定：分別從不同地理種群的暫養網箱內隨機取120條3～4 g幼蛭平均分3組放于同池塘編好號的60目水蛭養殖專用網箱(尺寸：100 cm×100 cm×110 cm)內進行成活率統計和生長指標比較試驗。池塘水溫平均24.9±1.2 ℃，pH 7.6～8.4，溶解氧6.13～7.02 mg/L，水深85 cm左右，網箱內部放栽種苦草的花盆2盆，直徑110 mm的PVC管2～3段，供幼蛭棲息。每隔5 d投喂殼寬9～12 mm左右的活的田螺，對每條幼蛭稱重，計算平均體質量。

生長指標的平均日增重、相對增重率和特定增重率分別按下列公式計算：

平均日增重：AGR/(g/d)=(W2-W1)/(t2-t1)

相對增重率：RGR/%=100×(W2-W1)/[W1×(t2-t1)]

特定增重率：SGR/%=100×(lnW2-lnW1)/(t2-t1)

式中：W2表示蛭第t2天平均體質量(g)，W1表示蛭第t1天平均體質量(g)。

1.5 數據統計分析

RAPD分析的PCR擴增產物的電泳位置在凝膠的某個相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0，如表2，形成RAPD的表型數據矩陣用NTSYS軟件計算相似系數(DICE系數)，并且按照遺傳距離進行UPGMA聚類分析。采用SPSS 13統計軟件對試驗數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，檢驗不同地域對寬體金線蛭生長指標影響的顯著性，用最小極差法(LSD)中的Duncan氏新復極差法進行多重比較，P<0.05視為具有統計學意義[15-16]。

表2 01數據統計(部分)

2 結果與分析

2.1 RAPD實驗檢測結果

利用RAPD分子標記技術對5個樣品進行遺傳多樣性分析，30條引物擴增如圖1、圖2。

圖1 PCR擴增產物檢測結果P1～P15(M:DL2000)

圖2 PCR擴增產物檢測結果P16～P30(M:DL2000)

2.2 供試材料的親緣關系分析

利用30對引物在5個樣品中獲得157條擴增片段，如表2。在NTSYS軟件中計算樣品間的遺傳相似系數(GS值)，得到供試材料遺傳相似矩陣。遺傳相似系數越大，表明親緣關系越近，遺傳相似系數越小，表明親緣關系越遠。由表3可知，5個樣品的GS值范圍為：0.6433～0.7707，變幅為0.1274。其中江蘇興化樣品和黑龍江賓縣樣品之間的遺傳相似系數最小，為0.6433，表明這兩個樣品之間的親緣關系較遠，遺傳差異性大。江蘇興化樣品和江蘇宿遷樣品之間的遺傳相似系數最大，為0.7707，表明江蘇興化樣品和江蘇宿遷樣品之間的親緣關系較近，遺傳差異性較小。

表3 5個不同地理群體之間的遺傳相似系數矩陣

2.3 RAPD分子標記聚類分析

利用UPGMA法進行聚類分析，根據遺傳相似系數對各樣品進行分類分析，聚類圖如圖3，從得到的聚類分析圖上可以看出，5個樣品分成2類，江蘇興化、江蘇宿遷、江蘇吳江、湖北大悟縣是第一類，黑龍江賓縣是第二類。其中第一類又分為2個亞類，第一亞類為江蘇興化、江蘇宿遷，第二亞類為江蘇吳江、湖北大悟縣。

圖3 UPGMA聚類分析法構建的不同群體寬體金線蛭的譜系關系

2.4 不同地理種群生長指標

仔蛭生長指標：由表4可見，黑龍江賓縣仔蛭的平均體質量從11日齡開始顯著低于(P<0.05)其它4個地區的平均體質量，生長較慢；江蘇宿遷仔蛭11日齡的平均體質量顯著低于(P<0.05)江蘇吳江地區的11日齡平均體質量。不同地理種群仔蛭前16 d的平均日增重均較平穩，從16 d到21 d的平均日增重均出現較前16 d的3～5倍增長。不同地理種群仔蛭的相對增重率和特定增重率均在6 d時較高，11 d和16 d依次下降，并在16 d時達到最低值，之后迅速增長，21 d時再次到達一個峰值(見圖4)。

幼蛭生長指標：由表5可見，黑龍江賓縣幼蛭平均體質量從31 d就出現了顯著低于(P<0.05)其他地區幼蛭平均體質量，其生長速率較慢。所有地區的幼蛭在1 d到61 d和91 d到121 d 期間的平均日增重基本差別不大，但61 d到91 d期間的平均日增重出現了零增長或極少量增長。相對增重率和特定增重率均呈現在31 d時最高，之后迅速下降，到91 d時達最低值，然后再呈增長趨勢(見圖5)。

表4 不同地理種群寬體金線蛭仔蛭不同日齡生長性狀比較

注：同列數字字母相同表示差異不顯著(P>0.05)；字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

表5 不同地理種群寬體金線蛭幼蛭不同日齡生長性狀比較

圖5 不同地理種群寬體金線蛭幼蛭121日齡生長曲線

3 討論

3.1 水蛭群體的遺傳多樣性

本研究的5個地理種群均為野生群體。結果表明，從遺傳相似系數來看江蘇和湖北群體間的遺傳差距較小，其中江蘇境內宿遷和興化兩個群體遺傳差距最小，遺傳相似系數為0.7707，江蘇太湖和湖北大悟縣群體次之，遺傳相似系數為0.7643，江蘇興化和黑龍江賓縣群體間的遺傳相似系數最小，為0.6433。聚類分析顯示，江蘇地區3個群體和湖北大悟縣群體聚為第一大類，黑龍江賓縣群體聚為第二大類，其中第一大類中江蘇興化和江蘇宿遷群體聚為第一亞類，江蘇吳江和湖北大悟縣群體聚為第二亞類。可見，遺傳距離與實際的地理距離是有一定的相關性的。

梁超等[17]、蔣速飛等[18]、楊慧榮[19]等用RAPD技術分別研究了魁蚶(Scaphareabroughtonii)、日本沼蝦(Macmbrachiumnipponensis)、黑鯛(Sparusmacrocephalus)不同地理群體的遺傳變異，群體間的遺傳相似系數為0.842～0.994。相比之下，寬體金線蛭不同地理群體的遺傳相似系數值較低，相互之間的遺傳差異較大。

3.2 不同地理種群生長指標

寬體金線蛭的生長速度主要與環境溫度和適口餌料相關。生長試驗中，不同地理種群仔蛭的生長溫度控制在其最適宜生長溫度25 ℃左右，餌料以浮游生物和適口田螺為主，5個地理種群21 d成活率均高達90%以上，說明此環境非常適合寬體金線蛭幼蛭生長，這一結果與王宣朋等[20]、熊良偉等[21]的研究基本一致。

在幼蛭的成活率和生長試驗中，前61 d各地區幼蛭成活數量均很高，基本沒有死亡，但在61～91 d期間死亡數量急劇上升，91 d時黑龍江賓縣和湖北大悟縣幼蛭僅剩53條、65條存活，江蘇3個地區寬體金線蛭成活數量也僅剩85～87條。當水溫從20 ℃升到27 ℃，寬體金線蛭生長正常，成活數量很高，但是當氣溫達到36 ℃，池塘水溫在32 ℃左右，高溫一直持續10 d左右時，各地區幼蛭均出現了停止攝食甚至死亡的現象，之后開始向池塘內24 h不間斷加注新鮮井水，使池塘水溫控制在27 ℃左右，各地區幼蛭死亡得到控制，這一結果進一步驗證寬體金線蛭生長對溫度條件的要求。本試驗中，121 d時江蘇省3個地區幼蛭成活率為70%左右，明顯高于湖北大悟縣(53.33%)和黑龍江賓縣(44.17%)，這可能跟原生長環境有關。王安綱指出，在其他條件不變的情況下，固著、隱蔽棲息和食物是構成寬體金線蛭分布的三大要素[22]。首先，江蘇省3個地區幼蛭均采自湖泊，地區間氣候差別不大，而湖北大悟縣和黑龍江賓縣的野生寬體金線蛭分別采自山溪、松花江等河流水域，常年水溫較低，這使得后者繁殖時間較前者晚，或者繁殖溫度較低，因此在江蘇省宿遷市的養殖不利于其繁殖習性；其次，江蘇省3個地區寬體金線蛭食物組成相似，但與湖北大悟縣和黑龍江賓縣相比，食物組成差別較大，其對寬體金線蛭的發育情況也會產生一定的影響；再次，江蘇省湖泊與湖北和黑龍江河流中寬體金線蛭固著、隱蔽棲息的介質不同，其對寬體金線蛭生長也存在一定的影響。

黑龍江賓縣的仔蛭和幼蛭平均體質量均表現出了顯著低于(P<0.05)其他地區幼蛭平均體質量，說明黑龍江賓縣地區的寬體金線蛭確實生長速度較慢。

綜上，基于本研究結果，目前江蘇3個地區的寬體金線蛭生長速度較快，是比較適合本地區養殖的，在寬體金線蛭的養殖購種時，最好選擇與本地環境相近的親本和蛭苗。結合RAPD研究結果，江蘇地區的品種遺傳距離較小，鑒于其生長較快的性狀，在今后的水蛭育種工作中可以對其抗病性等相關性狀進行種質改良。