24-油菜素內酯溶液浸泡處理對鮮切生菜褐變的影響

喬永祥，謝晶，雷昊

(上海冷鏈裝備性能與節能評價專業技術服務平臺，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海海洋大學 食品學院，上海,201306)

生菜又稱葉用萵苣，是一種營養豐富綠色健康的綠葉蔬菜，由于生菜中富含維生素、碳水化合物和礦物質等營養物質，常作為蔬菜沙拉食用[1-2]。生菜經過切割等處理加速了生理劣變，貯藏過程的酶促褐變是最常見的問題之一，嚴重影響鮮切產品的感官品質[3]。目前對于抑制褐變的物理化學方法有很多，抗壞血酸、胱氨酸、檸檬酸、草酸和1-甲基環丙烯等化學試劑[4]已被前人證明可以很好地抑制酶促褐變，然而這些化學防褐變方法提高了產品成本并且效率低[2]；熱處理、輻射等物理處理雖然對抑制褐變也有一定的效果，但這些物理處理方式損害了產品的感官特性和營養價值[5]。因此急需一種新的抑制褐變的方法替代原有的方法。

油菜素內酯(24-epibrassinolide，EBR)是一種由植物多羥基構成的，并被確認為一種新的天然無毒無害植物激素，在植物生長發育中起著至關重要的作用的物質，其存在于多種植物的器官中，參與很多生理和生化過程，是調節各種生理過程必不可少的物質[6]。有研究表明適當濃度的外源油菜素內酯處理還能有效緩解各種生物、非生物脅迫對植物造成的氧化損傷[7]，有效地維持采后果蔬的品質質量。ZHU等[8]將棗果在5 μmol/L油菜素內酯溶液中浸泡5 min可以很好地抑制青霉病，維持良好的外觀；GAO等[9]研究發現茄子經過油菜素內酯浸泡10 min可以很好地降低多酚氧化酶、過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶等活性，從而在貯藏期間抑制茄子果肉的褐變，延長貨架期；同時GAO等[10]以鮮切藕片為試驗對象，研究發現用80 nmol/L的油菜素內酯溶液浸泡10 min可以有效地抑制酚類代謝和與褐變相關酶活性如多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等，從而降低鮮切藕片表面褐變。

目前還沒有人將油菜素內酯用于抑制鮮切生菜的褐變。因此本試驗主要以鮮切生菜為研究對象，探討在貯藏過程中外源油菜素內酯處理對鮮切生菜褐變的影響，通過研究其對感官品質、褐變指數以及褐變相關酶的酶活性的影響，從而更好地理解油菜素內酯在抗褐變中的作用，并提供一種鮮切生菜保持品質質量和延長保質期的新工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮生菜：購自上海市浦東新區臨港新城某菜市場，挑選顏色鮮亮、脆嫩、無腐爛蟲害、大小一致的生菜為試驗原料。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機(H-2050R-1型)，長沙湘儀離心機有限公司；冰箱(BCD-252MHV型)，蘇州三星電子有限公司；紫外可見分光光度計(WFZ UV-2100)，上海龍尼柯儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 生菜預處理

將新鮮購買的生菜及時進行處理，挑選光鮮飽滿、大小均勻、無蟲害無缺損的生菜，將其切成3～5 cm小段，分別于自來水、5 μmol/L EBR、15 μmol/L EBR溶液(根據預實驗的研究結果確定)中浸泡10 min，記為CK、A、B組，撈出在通風陰涼處瀝干1 h。本試驗選取鮮切生菜葉脈[11]為研究對象，將浸泡好的鮮切生菜葉脈盛放在塑料托盤中，每個托盤80 g左右，并用保鮮膜封口，貯藏在(4±1) ℃冰箱中，每組大約準備8～10盒，以備后續指標測定。每次實驗每組樣品隨機選擇3盒，測量其褐變指數、多酚氧化酶活性、過氧化物酶活性、脂氧合酶活性、丙二醛含量以及感官品質評分。

1.3.2 感官質量評價

參照KING等[12]的方法，并稍加修改：每次邀請3名經過培訓具有一定蔬菜感官評價經驗的葉菜感官評價員組成評定小組，采用數字化評分方法(1～9分)對各試驗結果進行判別打分：9分為色澤鮮艷，質地脆嫩，切口無褐變；7分為色澤較鮮艷，切口出現輕微褐變；5分為貨架期終點，表現為色澤黯淡，切口褐變面積擴大；3分為切口褐變嚴重，葉片萎蔫，有異味；1分為嚴重腐爛，有異味。

1.3.3 褐變指數的測定

參考KIM等[13]略有修改，取2個生菜葉片組織，將其浸入40 mL蒸餾水和10 mL 10%三氯乙酸的混合溶液，室溫放置2 h后進行過濾。以蒸餾水作為對照，在420 nm波長下用紫外分光光度計測量濾液的吸光度。

1.3.4 多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)活性測定

參照ZHAN等[14]測定方法在480 nm處測定其吸光度。

1.3.5 過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性測定

參照ZHOU等[15]測定方法在420 nm處測定其吸光度。

1.3.6 苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase，PAL)活性測定

在290 nm處測定其吸光度[16]。

1.3.7 丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的測定

分別在450、532和600 nm測定其吸光度[17]。

1.3.8 數據處理與統計分析

各指標均做3次平行，均采用Microsoft Excel 2013軟件進行數據整理，試驗結果以“平均值±標準差”表示；用Origin 8.6軟件繪圖，應用SPSS Statistics 19.0進行差異顯著分析(p<0.05為差異顯著 )。

2 結果與分析

2.1 鮮切生菜感官品質的變化

由圖1可知，隨著貯藏時間的延長，各處理組的樣品感官評分逐漸降低，其中對照組樣品感官品質衰敗的最快，貯藏第3天，鮮切生菜在切口處出現輕微褐變，在第6天，切口處的褐變面積擴大，鮮切生菜葉片略微變黃萎蔫，在第9天，鮮切生菜切口褐變嚴重，葉片萎蔫，已有腐爛跡象，失去食用價值，這是可能是因為生菜經切割處理后造成組織結構破壞，導致乙烯產生，從而引起一系列的生理變化如菜葉褐變、黃化[18]。處理組B與對照組差異顯著(p<0.05)，在貯藏第9天，感官評評分為8.3，葉片柔嫩鮮綠，切口處表現出輕微褐變，在第12天，感官品質急劇下降，切口褐變嚴重，褐變面積增大，葉片萎蔫黃化，失去食用價值。SERNA等[19]研究發現香蕉果皮葉綠素降解相關的過氧化物酶活性異常高是香蕉果皮褐變的原因之一，因此推斷這可能是由于EBR處理抑制了其過氧化物酶活性，提高了鮮切生菜的抗逆性，從而保護了鮮切生菜鮮亮的色澤，使其保持良好的感官品質[20]。由此可見一定濃度的EBR處理可以保護鮮切生菜良好的外觀，抑制切口的褐變速度。

圖1 油菜素內酯對鮮切生菜感官品質的影響Fig.1 Effects of 24-epibrassinolide on sensory quality of fresh-cut lettuce

2.2 鮮切生菜褐變指數的變化

褐變指數通常被認為是一種間接的度量指標，用來反映由褐變反應生成的可溶性色素化合物含量，從而反映果蔬褐變程度[13]。貯藏期間鮮切生菜褐變指數的變化情況如圖2所示，由圖2可以看出隨著貯藏時間的增加，各處理組褐變指數呈上升趨勢，其中對照組褐變指數急劇上升，對照組CK和處理組A之間差異不顯著(p>0.05)，第6天處理組B與處理組A差異顯著(p<0.05)。在貯藏前期處理組B的褐變指數變化幅度不大，在第9天褐變指數為0.022，而CK組為0.042，貯藏末期褐變指數為0.064仍處于較低水平，而CK組為0.091，這可能是由于油菜素內酯附著在切口表面在一定程度上隔絕了環境中的氧氣，從而抑制了褐變的產生[21]，因此一定濃度的油菜素內酯溶液可以抑制鮮切生菜切口褐變，維持鮮切生菜鮮亮的外觀。

圖2 油菜素內酯對鮮切生菜褐變指數的影響Fig.2 Effects of 24-epibrassinolide on browning index of fresh-cut lettuce

2.3 鮮切生菜多酚氧化酶活性的變化

多酚氧化酶(PPO)是導致酶促褐變的主要酶，組織內的酚類物質被氧化為醌，形成褐色色素，參與褐變反應[22]，一般多酚氧化酶活性越高，褐變程度越大，因此PPO活性可以作為衡量預測褐變敏感性的一個指標。

圖3 油菜素內酯對鮮切生菜多酚氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of 24-epibrassinolide on polyphenol oxidase activity of fresh-cut lettuce

由圖3可以看出，各處理組均表現出先上升后下降的趨勢，其中各處理差異顯著(p<0.05)，對照組CK在貯藏前期PPO活性急劇上升，最高為30.14 U/g，這可能是因為鮮切處理造成生菜細胞組織被破壞，增大了與氧氣接觸的面積，加速褐變反應速度，在貯藏第12天，PPO活性迅速下降，這可能是由于隨著貯藏時間的延長，酶促反應的底物不斷減少，導致酶活性降低[23]。貯藏末期CK組的PPO活性為16.98 U/g，比處理組B高32%，這是因為經過油菜素內酯處理減少了切口表面多酚氧化酶和酚類物質的接觸，抑制了酶促褐變反應的進行[10]。處理組A對于PPO活性的抑制效果不如B組，可能是因為油菜素內酯溶液濃度過低。

2.4 鮮切生菜過氧化物酶活性的變化

植物體內的過氧化物酶(POD)是以單或雙酚類化合物為底物合成的[2]，而酶促褐變的重要底物是酚類物質，有研究表明在植物組織中，POD通常協同PPO引起鮮切果蔬的酶促褐變[24]，因此POD活性也是衡量褐變的一個重要指標。圖4為貯藏期間鮮切生菜POD活性的變化情況，由圖4可以看出，隨著貯藏時間的延長POD活性呈現出先上升后下降的趨勢，其中各處理組表現出差異性(p<0.05)，油菜素內酯處理顯著提高了POD活性，在貯藏末期處理B組的POD活性為15.88 U/g，是對照組的1.09倍，這可能是因為油菜素內酯處理可以增加 WRKY30 轉錄因子和防御相關基因的轉錄水平，從而導致POD活性顯著提高，清除細胞內的活性氧的能力增強，避免了活性氧的積累，從而達到抑制褐變的目的[25]。這與GAO和唐如雪等[10,20]研究的油菜素內酯處理提高了POD活性結果相一致。

圖4 油菜素內酯對鮮切生菜過氧化物酶活性的影響Fig.4 Effects of 24-epibrassinolide on peroxidase activity of fresh-cut lettuce

2.5 鮮切生菜苯丙氨酸解氨酶活性的變化

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是酚類物質合成的主要酶類之一，在一定程度上由于酚類化合物的積累，導致PAL活性增加，促進鮮切果蔬褐變反應的進行，因此PAL活性與鮮切果蔬褐變有著密切的關系。由圖5可以看出，對照組CK在貯藏前期PAL活性急劇上升，在第6天達到2.28 U/g，隨著貯藏時間的延長PAL活性逐漸開始下降，而處理組B在整個貯藏過程中PAL活性變化不大，與CK組差異顯著(p<0.05)，在貯藏末期PAL活性為1.22 U/g，比CK組低30%，這可能是因為經過油菜素內酯處理使其組織內產生的過氧化氫量減少，從而抑制了PAL的活性[9]。該結果與李麗花等[26]研究的油菜素內酯處理可以顯著提高杏果實中PAL活性的結果想類似，這說明油菜素內酯處理對鮮切生菜組織的褐變具有保護作用。

圖5 油菜素內酯對鮮切生菜苯丙氨酸解氨酶活性的影響Fig.5 Effects of 24-epibrassinolide on penylalanine ammonia lyase activity of fresh-cut lettuce

2.6 鮮切生菜丙二醛含量的變化

鮮切果蔬經過鮮切處理使切口組織的膜受到損傷，加快膜脂過氧化反應，從而促進褐變的進行，丙二醛作為膜脂過氧化作用的產物之一，能用來衡量和評價蔬菜膜系統受傷害的程度。由圖6可以看出，在貯藏期間各處理鮮切生菜的丙二醛含量呈上升趨勢，其中對照組上升趨勢尤為顯著，處理組A和對照組CK差異不顯著(p>0.05)，這可能是因為切割處理對生菜造成損害脅迫[27]，而處理組A的油菜素內酯濃度過低，不能對鮮切生菜的切口起到保護作用，從而使丙二醛含量沒有表現出明顯變化；處理組A和處理組B從第6天開始表現出差異性(p<0.05)，在貯藏末期處理組B丙二醛含量仍處于較低水平，比對照組少了28.57%，這是因為油菜素內酯處理可以調節植物組織內抗氧化酶的活性，維持細胞內外離子平衡，降低膜脂過氧化物MDA的產生[28]。這與WU等[29]研究的油菜素內酯處理可以抑制茄子中丙二醛含量的增加結果相一致。因此一定濃度的油菜素內酯溶液可以延緩鮮切生菜丙二醛含量的積累，減少細胞組織的破裂，避免褐變發生。

圖6 油菜素內酯對鮮切生菜丙二醛含量的影響Fig.6 Effects of 24-epibrassinolide on MDA content of fresh-cut lettuce

3 結論

鮮切生菜經過鮮切處理后，一方面造成機械損傷，增強膜脂質過氧化，促使丙二醛的含量積累增加，細胞破裂，氧氣與酚類物質接觸，加速褐變；另一方面鮮切可以誘導苯丙氨酸解氨酶活性，也與褐變有一定的因果關系[13]。本試驗以油菜素內酯浸泡10 min的鮮切生菜為試驗材料，以自來水清洗為對照組，研究貯藏期間油菜素內酯對鮮切生菜褐變的影響。結論如下：

在貯藏期間，對照組中鮮切生菜在第9天，切口褐變嚴重，葉片萎蔫，已有腐爛跡象，失去食用價值，而油菜素內酯處理效果明顯優于對照組，其中用15 μmol/L油菜素內酯處理鮮切生菜效果尤為顯著，在貯藏期間可以很好地抑制多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性，提高過氧化物酶的活性，延緩了丙二醛含量的積累，抑制了鮮切生菜褐變的發生，在第12天才失去食用價值，因此采用適宜濃度的油菜素內酯可以很好地抑制鮮切生菜的褐變，為今后研究鮮切生菜的保鮮和延長貨架期提供了一種新的嘗試和方向。