固相萃取整體捕集劑-氣相色譜-質譜聯(lián)用儀結合電子鼻技術對中華絨螯蟹關鍵脂質熱氧化體系的構建

付雪艷，吳娜，袁凱，王錫昌*

1 (上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(江西農業(yè)大學 食品科學與工程學院，江西 南昌，330045)

中華絨螯蟹是中國傳統(tǒng)的淡水養(yǎng)殖甲殼類水生動物，俗稱河蟹，系大宗名貴水產品之一。中華絨螯蟹味道鮮美、營養(yǎng)豐富，這與其豐富的脂肪和蛋白質含量組成密切相關，其中中華絨螯蟹的脂肪含量占總營養(yǎng)成分的13.33%[1]，在水產品中位居前列(貝類占2.71%，刀鱭占6.42%，海蟹占4.80%[2-4])。目前有關中華絨螯蟹基本營養(yǎng)成分、脂肪酸、氨基酸、揮發(fā)性物質等的研究已日益成熟，但是有關脂質熱氧化降解對中華絨螯蟹揮發(fā)性物質的作用的研究還很少見。脂質主要包括以磷脂為主的極性脂和由甘油三酯、游離脂肪酸和膽固醇等組成的中性脂。磷脂、甘油三酯和游離脂肪酸是脂質中對香氣貢獻最大的三種組分[5-6]。這些香氣物質多是一些醛、酮、醇等小分子化合物，其中很多化合物具有良好的風味特征[7]。

不少研究旨在探究脂質降解與揮發(fā)性物質生成的關聯(lián)，但還僅限于不同加工處理前后脂肪酸組成與揮發(fā)性成分的關聯(lián)性分析[8-9]，以及不同可食部位脂質組成變化及對揮發(fā)性成分的影響上[10-11]。基于本研究團隊之前對中華絨螯蟹在熱處理前后不同脂質組分含量變化的研究[12]，發(fā)現雌蟹性腺中的甘油三酯(triglyceride, TG)、甘油二酯(diglyceride, DG)和游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)以及雌蟹肝胰腺中的游離脂肪酸(FFA)和磷脂酰膽堿(phosphatidyl ethanolamine, PE)在蒸制之后出現顯著下降，由此推斷這幾種脂質為其相應可食部位對揮發(fā)性物質貢獻顯著的關鍵脂質。TG作為性腺中含量最多的脂質[13]，其在熱處理過程中很不穩(wěn)定，酰基鏈上的脂肪酸極易氧化降解，特別是多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)。其降解產物可能是DG和FFA，因此DG和FFA的變化就變得很復雜，一方面會因為中性脂和極性脂的不斷降解而增加，另一方面自身也會發(fā)生降解，最終其含量下降，說明其降解速率遠大于生成速率。SWEETEN[14]和DUCKETT[15]等的研究表明中性脂和極性脂由不同的脂肪酸組成，其中PUFA主要集中在極性脂上。倪逸群等[10]研究發(fā)現，極性脂中的C18∶1n-9c、C20∶1n-9、C20∶4n-6和C22∶6n-3脂肪酸對揮發(fā)性化合物的形成貢獻顯著，因此PE更容易發(fā)生降解。考慮到TG的量多且提取過程相對簡單[16]，PE的量多且下降明顯[11]，本實驗主要針對性腺TG和肝胰腺PE進行熱氧化體系的構建。基于此基礎筆者通過研究建立雌蟹性腺和肝胰腺關鍵脂質的熱氧化體系，為后續(xù)脂質熱氧化降解特性的研究提供條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

50只雌性中華絨螯蟹(150 g左右)于2015年10月采自上海市崇明中華絨螯蟹養(yǎng)殖基地。捕撈后的活蟹立即用棉線扎緊，置于帶有冰塊的泡沫箱中，于2 h之內運送至實驗室。清水沖洗后擦拭，活體剝離其性腺和肝胰腺，分別分裝后置于-40 ℃超低溫冰箱中儲藏備用。

試劑：氯仿、甲醇、二氯甲烷、正己烷、無水乙醚，以上均為分析純，國藥集團化學試劑公司；2, 4, 6-三甲基吡啶(純度>98.0%),東京化成工業(yè)株式會社Trimethyl pyride, TMP；

電子鼻Fox 4000，法國Alpha M.O.S公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；圓柱形萃取吸附-熱脫附吸附子MonoTrap RCC18(2.9 mm×5 mm，孔徑1 mm)，日本GL Sciences 公司；熱脫附器TDU、多功能進樣器MPS、冷卻型進樣口CIS，德國Gerstel 公司；旋轉蒸發(fā)儀，德國IKA集團；Silicic酸性硅膠柱(Kieselgel 60, 70目-230目)，德國默克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

分別稱取3 g性腺和肝胰腺于20 mL帶有橡膠墊片的棕色頂空瓶中(n=3)，經熱處理[17](時間：0、5、10、15、20、25、30 min; 溫度：60、70、80、90、100 ℃)后立即冷卻，用于GC-MS檢測。

分別稱取1 mg TG(添加水分6.15 μL)和12 mg性腺以及1 mg PE(添加水分15.19 μL)和31.15 mg肝胰腺于10 mL頂空瓶中[11](n=3)，經上述熱處理后立即冷卻，用于電子鼻分析。

1.2.2 揮發(fā)性氣味物質的測定

取上述分別經過熱處理后的樣品，加入2 μL濃度為10-5g/mL的TMP作為內標[18-19]，將3個老化并清洗后(保證沒有雜質及殘留)的吸附材料(MonoTrap RCC18)用固定裝置串聯(lián)后置于頂空瓶中樣品上方，于50℃吸附萃取30 min，以保證樣品中揮發(fā)性氣味物質萃取完全。然后將吸附材料從固定裝置上取下，并迅速裝入熱脫附玻璃襯管中，由多功能進樣器(MPS)將MonoTrap轉移至熱脫附器(TDU)中熱脫附，通過-40 ℃液氮冷阱(CIS)進行組分匯集，然后在高溫條件下汽化，進入儀器檢測。

實驗采用DB-5MS彈性毛細管柱(30 m×0.25 mm, 液膜厚度1 μm)；程序升溫參數參照ZHUANG, WU等研究[20-21]；采用不分流模式，流速1.2 mL/min，汽化室溫度240 ℃。

1.2.3 脂質的提取

1.2.3.1 總脂的提取

參照FOLCH[22]的方法，分別稱取(10.00±0.50)g雌蟹性腺和肝胰腺于燒杯中，經20倍體積的氯仿、甲醇(體積比為2∶1)于4 ℃下靜置提取24 h，經濾紙反復過濾，然后用0.03 mol/L MgCl2溶液于4 ℃反復萃取后，移除上層甲醇層，將氯仿層轉移至圓底燒瓶中，于40 ℃真空旋轉蒸發(fā)以去除溶劑至恒重，即得總脂肪。

1.2.3.2 關鍵脂質的提取

參照SAITO[16]的方法，稱取(10.00±0.50)g填料(silica gel 60 0.063 mm～0.200 mm)于酸性硅膠柱中，V(加入二氯甲烷)∶V(正己烷)=2∶3溶液200 mL用來活化柱子，然后加入0.5 g總脂肪，緊接著按照表1順序分離不同脂質組分：

表1 不同脂質組分洗脫程序[16]Table 1 Elution program of different lipid fractions

注：一些組分中會包含其他組分。

1.2.4 電子鼻分析

本實驗采用含有18根傳感器(分別為：組A：T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2；組B：P30/1、P40/2、P30/2、T40/2、T40/1、TA/2；組C：LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/g CTL、LY2/g CT)的Fox 4000 電子鼻，其能夠系統(tǒng)的對河蟹樣品進行整體氣味輪廓區(qū)分。為了使各個樣品保持狀態(tài)的統(tǒng)一，將稱好的樣品置于自動進樣系統(tǒng)的低溫托盤(4 ℃)上。采用動態(tài)頂空法采集氣體，進樣前樣品置于50 ℃平衡600 s以保證樣品釋放完全并均勻分散，進樣器溫度60 ℃，進樣體積2 500 μL，1 s進樣，以干凈空氣作為載氣，流速為150 mL/min，數據采集時間120 s，在進行下一個樣品分析之前，用潔凈空氣吹掃10 min，以防止樣品氣味的殘留。

1.3 數據處理

所有檢測結果均以平均值±標準偏差(Mean±SD，n=3)表示。采用SPSS 20.0對數據進行單因素分析(ANOVA)，所有差異分析均在p=0.05水平進行，電子鼻采用儀器工作站自帶的Alpha soft 14.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 雌性中華絨螯蟹性腺和肝胰腺熱處理時間的優(yōu)化

表2為雌蟹性腺0～30 min，100 ℃熱處理過程中的揮發(fā)性物質鑒定結果，可以看出隨著熱處理時間的延長，揮發(fā)性物質的種類呈不斷增加趨勢。生樣性

腺僅檢測出7種氣味物質，而當熱處理時間達到25 min和30 min時，檢測的氣味物質達到19種。由此可推斷熱處理時間為25 min以上時，其揮發(fā)性物質能釋放完全。6種氣味物質在30 min時被檢測的含量達到最高，其他氣味物質的含量均在25 min時被檢測到有最高值，并且所有被檢測到的氣味物質總含量均在25 min時達到最高。其中三甲胺、2-丁酮、3-甲基丁醛、戊醛、庚醛和苯甲醛在生樣中均未檢出，但在5 min開始檢出，被檢出的含量值在0～15 min呈現一定波動性，15～25 min之間各檢出物質的含量呈逐漸增加趨勢。25 min之后有13種物質含量有下降趨勢，這可能是由于已產生的揮發(fā)性物質進一步降解為小分子物質或者是與其他物質發(fā)生了進一步反應[23]。

表2 雌性中華絨螯蟹性腺加熱0～30 min過程中揮發(fā)性物質的鑒定 單位：ng/g

注：1.N.D. 表示未檢出；2.同一行不同字母表示存在顯著性差異 (p<0.05)；下同。

雌蟹肝胰腺在100 ℃熱處理0～30 min過程中氣味物質的變化如表3，肝胰腺生樣僅檢測出10種氣味物質，隨著熱處理時間的延長，被檢測到氣味物質種類依次增加，其中25 min時共檢測出23種氣味物質，其中16種物質含量達到最高值；而當熱處理時間為30 min時，檢測出22種氣味物質，其中7種氣味物質含量達到最高值，其他15種相對于25 min熱處理時均有下降，這與性腺結果相似，而2-(2-戊烯基)呋喃則未檢出，這可能是其發(fā)生了進一步降解；雌蟹肝胰腺經不同時間的熱處理，揮發(fā)性物質的含量波動較大，說明肝胰腺受溫度的影響要大于性腺，但總含量在25 min時達到最高。2-甲基-2-丁烯醛含量在15 min時達到最高，之后有明顯下降，這可能是由于15 min之后其降解速度大于生成速度。另外(E)-2-丁烯醛和2-戊基呋喃從10 min開始被檢出，2-甲基丁醛從20 min開始被檢出，(E)-2-庚烯醛從25 min開始被檢出。說明不同熱處理時間對不同揮發(fā)性化合物的生成和富集有顯著影響[24]。

表3 雌性中華絨螯蟹肝胰腺加熱0～30 min過程中揮發(fā)性物質的鑒定 單位：ng/g

揮發(fā)性化合物主要是一些小分子物質，而脂質和蛋白質作為揮發(fā)性化合物的重要風味前體物質[25-26]，其含量和組成對氣味物質的形成有很重要的作用。吳娜[11]對雌性中華絨螯蟹的基本營養(yǎng)成分研究得出，雌蟹性腺中蛋白質含量高于肝胰腺，而肝胰腺中的脂肪含量達40%，顯著高于性腺中的脂肪含量，說明肝胰腺具有高脂肪的特點。表2和表3的結果也顯示肝胰腺的整體氣味物質要比性腺豐富，這可能與其高脂肪含量有關。綜合上述結果可以得出，熱處理時間為25 min時雌性中華絨螯蟹的氣味物質種類最豐富。

2.2 雌性中華絨螯蟹性腺和肝胰腺熱處理溫度的優(yōu)化

選擇上述優(yōu)化的熱處理時間條件，采用GC-MS對中華絨螯蟹性腺和肝胰腺不同熱處理溫度下的揮發(fā)性物質進行測定，分別如表4和表5所示。

表4 雌性中華絨螯蟹性腺不同熱處理溫度下的揮發(fā)性物質鑒定 單位：ng/g

續(xù)表4

保留時間/min化合物加熱溫度/℃6070809010016.839糠醛3.93±0.184.36±1.143.03±0.25N.D.N.D.23.013苯甲醛19.15±2.39a35.18±3.09b45.82±6.14b116.09±9.06c142.00±11.54d23.9462-戊基呋喃N.D.N.D.N.D.5.03±0.6938.06±5.8424.3692-(2-戊烯基)呋喃N.D.N.D.N.D.6.03±0.7910.20±2.3224.461辛醛27.99±1.18a27.22±2.75a36.64±2.90b41.94±5.48b51.71±6.00c24.965(E,E)-2,4-庚二烯醛N.D.N.D.N.D.N.D.12.29±0.0228.6152-壬酮1.00±0.48a3.63±1.04b3.63±0.21b4.43±0.20bc5.31±0.24c29.365壬醛17.94±3.06a23.71±4.30a36.26±3.54b34.46±2.40b98.83±3.26c總計118.86±19.58a170.82±15.80b253.79±15.93c337.61±10.97d506.32±8.57e

表5 雌性中華絨螯蟹肝胰腺不同熱處理溫度下的揮發(fā)性物質鑒定 單位：ng/g

隨著溫度的升高，性腺中被檢出的氣味物質逐漸增加，在60、70、80、90和100 ℃熱處理時，分別檢測出11、11、12、14和20種氣味物質，其中三甲胺、1-戊烯-3-醇、戊醛、1-戊醇、甲苯、己醛、苯甲醛、辛醛、2-壬酮和壬醛在所設定溫度范圍內都有被檢測到；其含量值總體呈現遞增趨勢，這可能是隨著熱處理溫度的升高，大分子物質降解程度加劇的結果，并在100 ℃時其含量值達最大。所以此類物質也將是之后脂質熱氧化降解研究中應該要著重關注的。揮發(fā)性物質的總含量在100 ℃時達到最高，且顯著高于其他溫度水平，其中3-甲基丁醛、1-戊烯-3-酮、2-乙基呋喃、2-甲基-2-丁烯醛、二甲基二硫化物和(E,E)-2,4-庚二烯醛僅在100℃熱處理時才被檢出，這表征性腺中這些物質對熱處理溫度具有選擇性[24]。

雌性中華絨螯蟹肝胰腺不同熱處理溫度下的揮發(fā)性物質種類和含量相對于性腺要更豐富，其中在60、70、80、90和100 ℃熱處理后分別檢測出14、15、21、25和25種物質，除1-戊烯-3-醇、1-戊烯-3-酮、1-戊醇、甲苯和2-壬酮的含量在80 ℃時有下降趨勢之外，其他物質含量都隨著熱處理溫度的上升呈現遞增趨勢，在100 ℃時含量達到最高，這和性腺結果相似。80 ℃時這幾種物質的含量值逐漸下降，然而被檢測到的揮發(fā)性物質種類顯著增加，說明該溫度點對性腺氣味物質影響較大[17]。己醛和戊醛由亞油酸鹽氫過氧化物的分解產生[23]，80 ℃時才被檢出，這也驗證了上述結果。而三甲胺、3-甲基丁醛、2-戊基呋喃和壬醛在設定溫度范圍內都有被檢出，且含量隨溫度的上升而升高，100 ℃時含量達到最高。綜合上述結果，可以得出雌性中華絨螯蟹熱處理溫度和時間分別是100 ℃和25 min時其揮發(fā)性物質含量和種類都最豐富，能夠使其達到最佳風味。

2.3 雌性中華絨螯蟹關鍵脂質的熱氧化體系構建

國內外學者的研究也已經證實，醛類作為河蟹性腺和肝胰腺的主要香氣物質，主要來自于脂質和脂肪酸的熱降解[27]，而溫度、時間、水分、氧氣等作為脂質氧化的關鍵因素，是本實驗熱氧化體系的構建主要考慮的4種因素。本實驗通過向關鍵脂質中添加水分構建體外模型以還原蟹體原始脂質與水分比例。結合實際蒸制條件，熱處理溫度和時間選擇100 ℃，25 min，通過電子鼻對關鍵脂質的水分和氧氣條件進行優(yōu)化，構建完整的脂質熱氧化體系。

2.3.1 雌蟹性腺中TG熱氧化體系的構建

圖1為添加不同水分梯度的TG在100 ℃, 25 min熱處理之后的PCA圖，第一和第二主成分方差貢獻率之和(PC1%+ PC2%)為98.73，區(qū)分指數(Discrimination index, DI)為85，說明其能夠反映樣本信息的完整程度，且不同樣品之間可以進行很好的區(qū)分[28]。其中第一主成分貢獻率最高(91.039%)，因此在PC1方向上當添加水分為6 μL和9 μL時其氣味輪廓與性腺樣品最為接近[29-30]。結合性腺樣品中的實際水分與TG比值，確定當6 μL 為TG的最終水分添加量，此時其氣味輪廓與性腺樣品最為接近。

圖1 河蟹性腺中的TG在添加不同水分后的PCA圖Fig.1 PCA results of TG in gonads added with differentcontents of water

在添加6 μL水分的基礎上，通過對真空和正常有氧條件下的TG進行熱處理，結合電子鼻雷達圖結果進行分析(圖2)，可以看出有氧條件下的TG對各個傳感器的響應值與性腺樣品最為接近，整體氣味輪廓與樣品最為相似。其中傳感器P30/2, T30/1, LY2/g CTL, LY2/GH, LY2/AA和LY2/G在真空條件下相對樣品其響應值均變小，因此這些傳感器所對應的敏感物質類型[31]，如極性有機化合物、胺類化合物、氨、醛類、丙酮、碳氧化合物等是值得后續(xù)關注的。綜上所述，雌蟹性腺中的關鍵脂質TG的最優(yōu)熱氧化體系條件是：100 ℃, 25 min, 水分6 μL,正常有氧條件。

圖2 河蟹性腺及TG有氧和真空條件下的雷達圖Fig.2 Radar results of TG in gonads under aerobic and vacuum conditions注：Ox, 有氧條件；Va, 真空條件；以下同。

2.3.2 雌蟹肝胰腺中PE熱氧化體系的構建

同樣地，雌蟹肝胰腺PE中水分的添加以15 μL為基礎設置梯度，分別為0、7.5、15和22.5 μL，電子鼻結果如圖3-a所示，PCA圖區(qū)分指數為79，第一主成分貢獻率達到99.094%， 說明不同樣品在PC1方向上可以達到良好區(qū)分。PCA圖顯示添加不同水分的PE的氣味輪廓與肝胰腺樣品相差較遠，相對來說添加水分為0和15 μL時，PE的氣味輪廓與肝胰腺樣品最為接近。通過進一步對添加0和15 μL水分的PE和肝胰腺樣品進行PCA分析發(fā)現(圖3-b)，添加水分為0時，在PC1方向上，其氣味輪廓與樣品更為接近。在此基礎上對氧氣條件進行驗證，雷達圖中對各個傳感器的響應值可知(圖4)，真空條件下的PE對各個傳感器幾乎無響應，而有氧條件下除LY2/g CTL, LY2/GH, LY2/AA和LY2/G外，PE對各個傳感器的響應值與肝胰腺樣品最為接近。根據傳感器響應值的高低，說明肝胰腺的主要氣味集中在這幾個傳感器所對應的敏感物質上。綜合上述可知，雌蟹肝胰腺中PE的熱氧化體系條件為：100 ℃，25 min，水分0 μL，有氧條件。

圖3 河蟹肝胰腺中的PE在添加不同水分后的PCA圖Fig.3 PCA results of PE in hepatopancreas added with different contents of water

圖4 河蟹肝胰腺及PE有氧和真空條件下的雷達圖Fig.4 Radar results of PE in hepatopancreass under aerobic and vacuum conditions

3 結論與展望

MMSE結合GC-MS對雌性中華絨螯蟹性腺和肝胰腺熱處理過程中關鍵揮發(fā)性物質進行測定，根據關鍵揮發(fā)性物質在熱處理過程中含量及種類的變化，最終確定熱處理時間和溫度。在此基礎上通過電子鼻結合PCA圖和雷達圖對關鍵脂質的氣味輪廓與相應可食部位的氣味輪廓進行比較，對關鍵脂質的水分添加以及有氧和真空進行優(yōu)化，最終確定,性腺中關鍵脂質TG的熱氧化條件為：100 ℃，25 min，水分6 μL，有氧條件；肝胰腺中關鍵脂質PE的熱氧化條件為：100 ℃，25 min，水分0 μL，有氧條件。本研究對關鍵脂質進行熱氧化體系的構建，為脂質分子種、脂肪酸以及揮發(fā)性物質的測定提供反應條件，從而確定關鍵脂質分子種，為脂質熱氧化降解特性的研究提供基礎。