郫縣豆瓣的營養、多酚含量與抗氧化活性評價

袁旭，伍小宇，李偉麗，王慶慧，劉平，林洪斌，車振明，吳韜

(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039)

郫縣豆瓣主產于四川省成都市郫都區(原郫縣)，是中國地理標志產品。它以紅辣椒、蠶豆、小麥粉為主要原料，通過微生物制曲、前發酵，再經過翻、曬、露等后發酵工藝釀制而成，其制作技藝已經列入國家級非物質文化遺產名錄[1]。郫縣豆瓣具有色澤紅褐油潤、瓣粒香脆、味鮮辣及醬酯香等特點，是川菜食譜中最常用的調味品之一，被譽為“川菜之魂”。

以往研究表明，發酵調味品不僅具有獨特的感官特征，還具有顯著的生理活性。例如日本納豆是以大豆為原料，經過納豆芽孢桿菌發酵后制成，具有抗癌、溶解血栓、降血壓、抗氧化、抗菌等多種生物活性[2]。盡管郫縣豆瓣距今已有300多年的歷史，對它的研究還主要集中在發酵菌群、風味成分、辣度及生產工藝等方面，而對其營養成分及功能活性研究極少。在國標GB/T 20560—2006《地理標志產品郫縣豆瓣》中，僅針對郫縣豆瓣的水分、氨基酸態氮、總酸、食用鹽、酸價及過氧化值這些理化指標提出了規范要求[3]。多酚是一類廣泛存在于植物體內的具有多元酚羥基結構的次生代謝物，包括酚酸、黃酮、單寧等化合物。其結構中的鄰位酚對活性氧等自由基具有很強的捕捉能力, 這使得多酚類成分通常具有較強的抗氧化性以及清除自由基的能力。近年來許多學者亦認為經常攝入含有植物多酚的食物，與降低癌癥、心血管疾病、關節炎等慢性病的發病率具有密切相關性[4]。

隨著我國經濟水平的日益提高，人們對調味品的要求已不再僅限于吃飽吃好，而是將風味、營養與預防疾病等需求統一聯系起來。本文擬通過對市場上郫縣豆瓣醬的營養、多酚類成分及抗氧化活性進行初步評價，以期為今后郫縣豆瓣醬工藝改進，標準提高及相關功能食品開發等提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10種不同品牌郫縣豆瓣醬2017年5月購于成都超市。沒食子酸、抗壞血酸、蘆丁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、三吡啶三吖嗪(2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ)，美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

K1100型全自動凱氏定氮儀、SOX406型脂肪測定儀，山東海能科學儀器有限公司；SpectraMax i3x多功能酶標儀，奧地利Molecular Devices公司；TD-5M型離心機，四川蜀科儀器有限公司；萬能高速粉碎機，深圳尼嘉商貿有限公司；Heto-HSC500真空冷凍干燥機，上海佰蕾真生物科技有限公司；DHG-9075A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取50 g供試樣品置于-50 ℃真空冷凍干燥機24 h，干燥后用高速粉碎機將豆瓣粉碎，盛裝在潔凈密封袋中，備用。

1.3.2 化學成分測定

1.3.2.1 脂肪的測定[5]

所有樣品脂肪含量的測定均按GB/T 5009.6—2003規定的方法，采用索氏抽提法。

1.3.2.2 蛋白質測定[6]

所有樣品蛋白質含量的測定均按GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》規定的方法，采用凱氏定氮法。

1.3.2.3 灰分測定[7]

所有樣品灰分含量的測定均按GB 5009.4—2016規定的方法，采用灼燒法。

1.3.3 樣品提取液制備[8]

稱取待測豆瓣樣品粉末2 g加入20 mL體積分數為60%的乙醇溶液，于50 ℃、70 W超聲波提取30 min，4 000 r/min離心15 min，取上層清液5 mL過0.45 μm濾膜，濾液待測。

1.3.4 總黃酮含量的測定[9]

采用AlCl3-NaOH-NaNO2法測定樣品中總黃酮的含量。取50 μL樣品提取液與20 μL 0.5 mol/L NaNO2溶液于96微孔板中，室溫孵育5 min后，加入20 μL 0.3 mol/L AlCl3·6H2O溶液室溫旋轉孵育6 min，加入200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液旋轉混合均勻，于波長510 nm處測吸光度，讀數前搖動微孔板30 s。以蘆丁為標準品(0～0.5 mg/mL)繪制標準曲線(y=0.046 22+1.428 83x，R2=0.999 11)。結果以毫克蘆丁當量每克干物質計(mg蘆丁當量/g)。

1.3.5 總多酚含量的測定[10]

采用Folin-Ciocalteu法測定樣品中的總多酚含量。取25 μL樣品與125 μL 質量分數10%的福林酚試劑于96微孔板中，輕輕旋轉微孔板使其混勻，靜置8～10 min，然后加入125 μL 質量分數7.5%的Na2CO3溶液，避光反應30 min，于波長765 nm處測吸光度。以沒食子酸為標準品(0～300 mg/L)繪制標準曲線(y=0.111 94+0.006 66x，R2=0.998 63)，結果以毫克沒食子酸當量每克干物質計(mg GAE/g)。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測定[11]

用體積分數60%的乙醇溶液將樣品提取液分別按2、4、8、16、32倍進行稀釋。吸取50 μL稀釋后的樣品與200 μL 0.5 mmol/L新鮮配制的DPPH溶液(60%乙醇)于96微孔板中，在酶標儀上振蕩10 s混勻，室溫避光反應30 min，于波長517 nm處測吸光度。以水溶性抗壞血酸(0.062 5～1.0 mmol/L)為標準品繪制標準曲線。DPPH自由基清除能力按下列公式計算：

(1)

式中：ACDPPH，DPPH自由基清除能力，%；Aa，DPPH與體積分數60%的乙醇混合液的吸光度；Ab，60%乙醇與樣品混合液的吸光度；As，DPPH與樣品混合液的吸光度。

1.3.7 還原能力的測定[12]

采用鐵離子還原能力(Ferric reducing antioxidant power，FRAP)法測定不同樣品提取液中總抗氧化能力。配制10 mmol/L TPTZ溶液：稱取0.031 23 g TPTZ，用40 mmol/L鹽酸溶液定容至10 mL；配制FRAP工作液：由0.3 mol/L pH 3.6醋酸緩沖液，20 mmol/L三氯化鐵溶液和10 mmol/L TPTZ溶液按10∶1∶1(體積比)組成，臨用前混合。取100 μL樣品于反應管中，加入3 mL FRAP工作液，混勻后置于37 ℃水浴10 min，分別吸取200 μL 混合液于96微孔板中，于波長593 nm處測吸光度。以水溶性抗壞血酸(0.062 5～1.0 mmol/L)為標準品繪制標準曲線(y=0.072 06+0.000 65x，R2=0.999 64)，結果以微摩爾水溶性抗壞血酸當量每克干物質計(μmol VC/g)。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 營養成分含量分析

在微生物發酵過程中，豆瓣原料中的一些蛋白會被降解，而有些新蛋白會被合成。因此豆瓣醬中蛋白質含量是原料中蛋白質總量與微生物代謝總量的綜合反映。由表1可以看出，不同品牌豆瓣醬的蛋白質含量的變化為5.14%～16.98%，除2號與6號樣品之間無顯著差異外(p>0.05)，其余豆瓣醬樣品蛋白質含量均存在顯著性差異(p<0.05)。

表1 不同品牌豆瓣醬中脂肪、蛋白質、灰分含量Table 1 Fat, protein and ash contents in differentbean pastes

注：同列肩標不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

豆瓣醬中的脂肪主要來源于原料中的蠶豆、辣椒和面粉，以及外加的辣椒紅油。其脂肪含量的變化為2.26%～23.51%。除了8號與9號、4號與5號、2號與3號之間無顯著性差異外(p>0.05)，其余均有顯著性差異(p<0.05)，此外，紅油豆瓣(1～7號樣品)脂肪含量顯著高于老豆瓣(8～10號樣品)，這是因為紅油豆瓣在工藝中加入了辣椒紅油。

灰分是標示食品中無機成分總量的一項指標。由表1可以看出郫縣豆瓣醬中的灰分含量的變化為3.74%～4.81%，除1號和2號，3、9和10號樣品之間無顯著性差異外(p>0.05)，其余均有顯著性差異(p<0.05)，所有樣品的灰分含量均在3%以上，主要來源于生產過程中加入的食鹽以及豆瓣醬原料中的無機鹽等。

2.2 總多酚、總黃酮含量分析

豆瓣醬的總多酚含量的范圍為2.290～5.385 mg沒食子酸當量/g，其含量最高值約為最低值的2.4倍。總黃酮含量的范圍為0.660～2.298 mg蘆丁當量/g，其含量最高值約為最低值的3.5倍。

2.3 抗氧化活性評價

2.3.1 DPPH自由基清除能力評價

分別配制不同濃度的豆瓣樣品，并測定其對DPPH自由基的清除率，根據每個樣品不同濃度對DPPH自由基清除率，繪制DPPH自由基清除能力曲線圖(圖1)。ICDPPH 50值表示降低DPPH初始吸光度值50%所需的樣品的濃度(mg/L)，ICDPPH 50值越小，表示其清除自由基的能力越強，即抗氧化活性越強。由圖1可知，同一豆瓣醬樣品隨著提取物濃度的增大，其DPPH自由基清除能力逐漸增大。除10號與7號、9號，2號與6號的ICDPPH 50值之間無顯著差異外(p>0.05)，其余均有顯著性差異(p<0.05)。本實驗以天然抗氧化劑水溶性VC作為對照，其ICDPPH50值為4.724×10-3mg/mL，而不同品牌豆瓣醬ICDPPH50值最小值為7.662 mg/mL，表明各樣品的清除自由基的能力均顯著弱于Vc，不同品牌抗氧化能力由大到小依次為：7號、10號、9號、1號、6號、2號、3號、8號、5號和4號。

圖1 不同濃度豆瓣醬提取物對DPPH自由基的清除效果Fig.1 DPPH free radical scavenging effects of extracts various concentrations from bean paste

2.3.2 還原能力評價

由表2可知，豆瓣醬的FRAP值(氧化鐵還原能力)的變化范圍為11.474～45.967 μmol VC/g，除了4號、5號與3號、6號，8號與6號，7號、1號與3號、10號，9號與3號無顯著性差異(p>0.05)外，其余均有顯著性差異(p<0.05)。FRAP值越大，其抗氧化性越強，因此10種品牌豆瓣醬抗氧化能力由大到小依次為：10號、1號、7號、3號、9號、2號、5號、4號、6號、8號。

表2 豆瓣醬提取物中總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性Table 2 Total polyphenol and flavonoid contents and antioxidant activities of extracts from bean paste

續表2

試驗號總黃酮含量/(mg蘆丁·g-1)總多酚含量/(mg GAE·g-1)ICDPPH 50值/(mg·mL-1)FRAP值/(μmol VC·g-1)72.298±0.127g5.385±0.140f7.662±0.248a40.694±4.204ef80.823±0.155ab2.290±0.128a32.766±1.248f11.474±1.018a92.141±0.122fg5.211±0.166f10.851±0.888b30.797±3.985d102.046±0.184f5.128±0.115f9.396±0.274ab45.967±6.376f

注：同列肩標不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.4 總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關性分析

為比較豆瓣中總黃酮、總多酚含量與其抗氧化關系，采用Pearson′s方法進行相關分析，由于ICDPPH 50值越小，表示其抗氧化活性越強，因此采用ICDPPH 50倒數值進行相關性分析。結果如表3所示，總黃酮、總多酚含量與DPPH自由基清除能力之間呈顯著正相關，與還原能力之間呈極顯著相關，其中總黃酮含量與DPPH自由基清除能力、還原能力之間的相關系數r分別為0.727和0.867；相關性分析顯示，還原能力與總黃酮含量和總多酚含量均具有較好的相關性，相關系數r分別為0.867和0.866；DPPH自由基清除能力與總黃酮、總多酚含量的相關性系數r分別為0.727和0.714，以上數據表明多酚、黃酮類物質是豆瓣醬中主要的抗氧化劑。

表3 不同品牌豆瓣醬提取物的總黃酮、總多酚含量 與抗氧化活性相關性分析Table 3 Correlation analysis between total phenolic and flavonoid contents and antioxidant activities from different extracts of bean pastes

注：*顯著相關(p<0.05)；**極顯著相關(p<0.01)。

3 討論

3.1 不同品牌郫縣豆瓣醬營養成分之間差異

本研究發現不同品牌的郫縣豆瓣醬的蛋白質、脂肪含量差異極顯著，例如4號樣品的蛋白質含量僅為10號樣品的42%，而脂肪含量是10號的3.4倍。這種顯著差異一方面在于原料成分存在差異，另一方面可能在于這2種豆瓣醬的制造工藝不同。10號樣品為采用傳統工藝加工的豆瓣醬，發酵周期在1年以上，俗稱老豆瓣。而4號樣品為紅油豆瓣醬，其發酵工藝與傳統工藝類似，但是發酵周期較短，一般僅為3個月。此外，紅油豆瓣醬還會加入植物油進行封存。目前國標GB/T 20560—2006及第1號修改單雖然提到豆瓣醬可以加入植物油封存，但未對郫縣豆瓣的加油量進行規定，因而不同品牌的紅油豆瓣的加油量可能存在較大差異，進而會對郫縣豆瓣的營養成分產生顯著影響。本研究首次對郫縣豆瓣的營養成分進行評估，為今后豆瓣質量標準改進與提升奠定了基礎。

3.2 郫縣豆瓣的多酚和黃酮含量與抗氧化活性之間的關系

本研究采用DPPH自由基清除方法，FRAP總抗氧化能力方法評價了不同豆瓣的抗氧化活性，2種方法采用了抗壞血酸作為參照，為不同研究結果之間進行比較提供了參考。此外總黃酮、總多酚含量與DPPH自由基清除能力之間呈顯著正相關(r分別為0.727、0.714)，與FRAP總抗氧化能力之間呈極顯著相關(r分別為0.867、0.866)，表明多酚、黃酮類物質可能是豆瓣醬中主要的抗氧化成分。

4 結論

本研究首次針對郫縣豆瓣醬的營養成分(蛋白質、脂肪、灰分)、功能成分(總多酚、總黃酮)含量以及體外抗氧化活性進行評價。研究結果表明，不同品牌豆瓣醬中的蛋白質、脂肪、灰分的含量存在顯著差異，其不僅與原料有關，還可能與郫縣豆瓣加工工藝有關。此外郫縣豆瓣具有顯著的抗氧化活性，多酚、黃酮類物質可能是豆瓣醬中主要的抗氧化物質。未來還需要采用分離純化手段進一步明確郫縣豆瓣的多酚、黃酮類物質的詳細組成。本文為今后郫縣豆瓣醬工藝改進，郫縣豆瓣相關功能食品開發等提供理論支持。