超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定飲料中γ-羥基丁酸及其前體物質(zhì)

龔蕾，韓智，劉杰，朱曉玲，王會霞，彭青枝

(湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢，430075)

γ-羥基丁酸(GHB)具有強(qiáng)烈的鎮(zhèn)靜作用和健忘效果，并且無色無味，其鈉鹽穩(wěn)定存在，很容易加入到飲料中而不被發(fā)覺；同時，GHB也能刺激人體分泌荷爾蒙素，增加快感，因此GHB往往又與性犯罪聯(lián)系在一起，在娛樂場所被濫用，帶來了嚴(yán)重的社會問題[1]。歐美很多國家已經(jīng)將GHB列為一類藥品管制，我國于2001年5月將GHB列為二類精神藥物進(jìn)行管理，2007年我國將其列入一類精神藥物進(jìn)行管制[2]。但是由于原料易得和合成簡單，其違法使用情況依然存在，此現(xiàn)象引起了人們的廣泛重視。γ-丁內(nèi)酯(GBL)作為一種食品添加劑可用于食品合成香料領(lǐng)域，1,4-丁二醇(1,4-BD)可作為食品接觸材料添加劑運(yùn)用于包裝材料中。然而，GBL在酶催化作用下或提高pH情況下，可以很快轉(zhuǎn)化為GHB；1,4-BD在人體中也很快代謝為GHB，3種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式見圖1。

目前并沒有同時檢測食品中GHB、1,4-BD及GBL的國家標(biāo)準(zhǔn)，只有一個公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GA/T 1074—2013《生物樣品中γ-羥基丁酸的氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢驗(yàn)方法》[3]，但該標(biāo)準(zhǔn)的檢測對象為生物樣品(尿液、血液、組織和毛發(fā))，檢測物質(zhì)僅是GHB。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，GHB的分析方法主要有氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)[4-6]、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)[4, 7-10]和毛細(xì)管電泳法(CE)[11]等。氣相色譜法(GC)應(yīng)用較少，主要是由于GHB分子量小，且含有一個羥基和一個羧基兩個強(qiáng)極性基團(tuán)，熱穩(wěn)定性不好。與GC相比，GC-MS應(yīng)用較為廣泛，但是一般也需要衍生化處理或?qū)HB轉(zhuǎn)化為GBL，因此也只能檢測一種物質(zhì)。WOOD等[12]以C18為固定相，以甲醇-0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液為流動相，對尿液中的GHB、GBL、1,4-BD進(jìn)行了分析，檢出限為1 mg/L。張浩杰[13]將飲料用濾膜過濾后，用T-3色譜柱分離，以甲醇-水為流動相梯度洗脫，串聯(lián)質(zhì)譜MRM模式檢測，5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)有效分離。施妍等[14]利用HPLC-MS/MS測定尿液中的GHB、1,4-BD和GBL，檢出限分別為0.1、0.1和2μg/mL，準(zhǔn)確度為87.6%～98.1%。

圖1 GHB(a), GBL(b)和1,4-BD(c)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of GHB, GBL and 1,4-BD

目前，針對生物樣品例如尿液血液中的GHB含量檢測已經(jīng)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5-10]。然而，由于GBL和1,4-BD在人體中都可以很快代謝成GHB，并且GHB自身在體內(nèi)也會很快代謝，導(dǎo)致生物樣品中GHB及其相關(guān)物質(zhì)的檢測具有較強(qiáng)的時效性，從而給實(shí)際案件的鑒定和確證工作帶來了很大的不確定性。而且，GHB內(nèi)源性的天然物質(zhì)，國際毒理學(xué)會建議人體尿樣中GHB的臨界值(cut-off值)為10 μg/mL，這給實(shí)際尿樣陽性結(jié)果的判斷帶來一定困難。GHB，GBL和1,4-BD經(jīng)常被犯罪分子故意添加到飲料中進(jìn)行犯罪活動，而三者在飲料中不會發(fā)生代謝，穩(wěn)定性較高，因此有必要建立飲料中GHB，GBL和1,4-BD的含量檢測方法，為GHB及其前體物質(zhì)的合法性提供數(shù)據(jù)。本文建立了飲料中GHB，GBL和1,4-BD同時檢測的UPLC-MS/MS分析方法，此方法快速準(zhǔn)確，是一種方便且可靠的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Water Xevo-TQD三重四級桿質(zhì)譜儀，美國Waters公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；P型移液器，德國Brand公司；離心機(jī)，美國Beckman Coulter公司；0.22 μm濾膜，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

γ-羥基丁酸鈉(純度≥98.0%)，美國MedChemExpress公司；γ-丁內(nèi)酯(純度≥99.9%)，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；1,4-丁二醇(純度≥99.6%)，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；乙酸銨、甲酸(色譜純)，美國Fisher公司；乙腈、甲醇(色譜純)，德國Merck KgaA公司；飲料樣品購置于網(wǎng)絡(luò)平臺或市售，包括固體飲料(按照產(chǎn)品推薦的沖調(diào)倍數(shù)稀釋)。

GHB、1,4-BD、GBL單標(biāo)溶液：分別稱取100 mg標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用超純水稀釋并定容到刻度，配制成1 mg/mL的單標(biāo)溶液，備用。

GHB、1,4-BD、GBL基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取一定體積GHB、1,4-BD、GBL單標(biāo)溶液于10 mL容量瓶中，用稀釋了25倍的空白樣品提取液定容到刻度，配制成0.5、1.0、2.5、5.0、10.0μg/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.2 UPLC-MS/MS條件

1.2.1 UPLC條件

Thermo Gold C18(150 mm×2.1 mm，3.0 μm)色譜柱；流動相：A為2 mmol/L乙酸銨水溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序見表1；流速0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正負(fù)離子模式同時掃描；毛細(xì)管電壓：2 000 V；源溫度：120 ℃；脫溶劑溫度：300 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；錐孔氣流量：30 L/h；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。

1.3 樣品前處理

1.3.1 不含蛋白飲料

稱取1 g樣品(精確至0.01 g)于25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，經(jīng)微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，根據(jù)實(shí)際濃度適當(dāng)稀釋至線性范圍內(nèi)，供UPLC-MS/MS測定。

1.3.2 含蛋白飲料

稱取1 g樣品(精確至0.01 g)于25 mL容量瓶中，加入2 mL甲醇，搖勻，以沉淀蛋白質(zhì)，再加水定容至刻度，混勻，轉(zhuǎn)移至離心管中于4 500 r/min下離心15 min，取上清液，經(jīng)微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，根據(jù)實(shí)際濃度適當(dāng)稀釋至線性范圍內(nèi)，供UPLC-MS/MS測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用蠕動泵分別將質(zhì)量濃度為10 μg/mL的GHB、1,4-BD、GBL單標(biāo)溶液注入離子源，以便于對質(zhì)譜分析條件進(jìn)行優(yōu)化。在全掃描方式下分別對3種化合物進(jìn)行一級質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)1,4-BD和GBL在正離子模式下響應(yīng)較高，GHB在正離子和負(fù)離子模式下均有響應(yīng)，但據(jù)后續(xù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同時測定3種化合物需要采用正負(fù)離子同時掃描。本實(shí)驗(yàn)GHB采用負(fù)離子掃描模式，1,4-BD和GBL采用正離子掃描模式，并在各自對應(yīng)的模式下得到各自的分子離子峰，通過優(yōu)化錐孔電壓使各分子離子峰達(dá)到最大響應(yīng)值；再分別對分子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析(子離子掃描)，得到相應(yīng)的碎片離子，并通過優(yōu)化碰撞能量使碎片離子達(dá)到最大響應(yīng)值。得到最佳質(zhì)譜條件見表2。

表2 三種化合物的定性離子、定量離子、錐孔電壓 和碰撞能量Table 2 Qualitative ion, quantitative ion, cone voltage and collision energy of three compounds

注：a-定量離子；b-定性離子

2.2 源參數(shù)優(yōu)化

圖1展示了GHB和GBL的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，GBL是由GHB脫去1分子水縮合而成的環(huán)狀化合物。有國外文獻(xiàn)報(bào)道了GHB和GBL在源內(nèi)的相互轉(zhuǎn)化[7, 9]，即“源內(nèi)裂解”，而已有的國內(nèi)文獻(xiàn)則并未提及。源內(nèi)裂解主要是指由于離子化過程較為劇烈，使得生成的離子具有足夠的內(nèi)能發(fā)生進(jìn)一步裂解，如失H2O、失糖苷等，生成的基團(tuán)(子離子)與某種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)一樣而被作為“母離子”繼續(xù)被裂解。源內(nèi)裂解的過程與四級桿MS/MS的裂解過程十分相似，后者主要是使用一個相對較低的碰撞能量來產(chǎn)生碎片，其觀察到的碎片離子依賴于碰撞能量的大小，而源內(nèi)裂解的過程主要依賴于源區(qū)的接口電壓的大小，一般而言，源內(nèi)裂解只能減少而不能消除。在本試驗(yàn)中也觀察到了源內(nèi)裂解現(xiàn)象，因此，降低源內(nèi)裂解程度是本試驗(yàn)所關(guān)注的重點(diǎn)。研究表明，降低源溫度及噴霧電壓能有效減少源內(nèi)裂解程度，但同時會降低離子豐度。本試驗(yàn)綜合考慮得出最佳條件為：源溫度120 ℃，噴霧電壓2 000 V，脫溶劑溫度300 ℃，脫溶劑氣流速為800 L/h。

GHB在ESI+模式下失水產(chǎn)生87.0的碎片離子，此碎片離子的質(zhì)量數(shù)與GBL在ESI+模式下的一級母離子質(zhì)量數(shù)一致；GBL則容易加水產(chǎn)生105.0的離子，此離子與GHB在ESI+模式下的一級母離子質(zhì)量數(shù)一致，若同時采用ESI+模式掃描，則不能從色譜圖區(qū)分2種化合物，見圖2-e與圖2-f。因此，GHB采取ESI-模式掃描，GBL與1,4-BD采用ESI+模式掃描，能從色譜圖上區(qū)分開來。由2-a為GHB的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣后得到的總離子流圖(TIC)，圖2-b為GBL的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣后得到的總離子流圖，從圖2-a中可以看出GHB單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中，在相同保留時間(3.13 min)的地方也出現(xiàn)了GBL的峰，圖2-b中GBL的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖中顯示GBL的出峰時間為3.70 min，此結(jié)果顯示GHB易發(fā)生源內(nèi)裂解，與JOHANSEN[7](圖2-c)和S?RENSEN[9](圖2-d)的研究結(jié)果一致。因此，建議采取合適的洗脫梯度將GBL與GHB完全分離。

a-GHB單標(biāo)TIC圖；b-GBL單標(biāo)TIC圖；c-JOHANSEN研究結(jié)果；d-S?RENSEN研究結(jié)果；e-ESI+模式下GHB的TIC圖；f-ESI+模式下的GBL的TIC圖圖2 源內(nèi)裂解相關(guān)色譜圖Fig.2 Some chromatograms of in-source collision-induced dissociation

2.3 三種物質(zhì)的定量分析方法考察

2.3.1 色譜柱的選擇

本研究中的3種目標(biāo)化合物中，GHB為極性化合物，1,4-BD為弱極性化合物，GBL為非極性化合物，因此，在選擇色譜柱時，應(yīng)兼顧保留極性化合物同時對中等極性和非極性化合物也應(yīng)有所保留。本研究比較考察Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)、Waters Atlantis T3(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)、Thermo Gold C18(150 mm×2.1 mm, 3.0 μm)三種實(shí)驗(yàn)室常用的色譜柱，結(jié)果表明，GHB、1,4-BD在前兩種色譜柱上保留較差，而Thermo Gold C18(150 mm×2.1 mm, 3.0 μm)色譜柱對GHB、1,4-BD有保留，峰型較好(圖3)。因此，本研究初步選擇 Thermo Gold C18(150 mm×2.1 mm, 3.0 μm)色譜柱開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 GHB、1,4-BD和GBL總離子流圖Fig.3 Total lon chromatograms of GHB, 1,4-BD and GBL

2.3.2 流動相的選擇

液相使用的流動相為乙腈和2 mmol/L乙酸銨溶液。前期比較考察了乙腈-水(圖4-a)、乙腈-2 mmol/L乙酸銨溶液(圖4-b)、甲醇-水(圖4-c)和甲醇-2 mmol/L乙酸銨溶液(圖4-d)4個流動相體系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)采用乙腈時，所得到的色譜峰峰型較尖銳，因此選擇乙腈作為流動相體系之一；當(dāng)采用水作為流動相時，GHB出峰時間延后，但其色譜峰較寬，峰形較差，將水相中加入甲酸或乙酸銨后，其色譜峰峰形明顯改善。另外，鑒于本實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜部分所采用的掃描模式為正負(fù)離子同時掃描，所以選擇低濃度的乙酸銨溶液作為流動相可有效避免甲酸對負(fù)離子掃描的抑制作用，同時避免高濃度的鹽可能會造成的離子競爭抑制。因此，最終選擇以乙腈-2 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相。

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)

UPLC-MS/MS是水溶液中藥物殘留的首選檢測方式之一，但是這種檢測方式的一個主要缺點(diǎn)是具有基質(zhì)效應(yīng)(matrixeffects，ME)。一般來說，當(dāng)ME在80%～120%時，表明基質(zhì)效應(yīng)在可接受范圍內(nèi)，在實(shí)際檢測中可以忽略基質(zhì)效應(yīng)。本研究比較了樣品直接過膜上機(jī)和將樣品進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋后再上機(jī)檢測兩種處理方法，并比較了不同稀釋倍數(shù)對檢測結(jié)果的影響。

參照張浩杰等[13]對飲料的處理方式以及后期優(yōu)化前處理?xiàng)l件進(jìn)行處理分析，表3為樣品的加標(biāo)回收率。可以看出，直接過膜上機(jī)對GHB和1,4-BD的回收率較低，不滿足實(shí)驗(yàn)要求，同時也表明，飲料基質(zhì)對GHB和1,4-BD的檢測存在較強(qiáng)的基質(zhì)干擾。

a-乙腈-水;b-乙腈-2 mmol/L乙酸銨;c-甲醇-水;d-甲醇-2 mmol/L乙酸銨圖4 不同流動相的影響Fig.4 The effects of different flow phases

表3 GHB、1,4-BD、GBL回收率(直接過膜上機(jī)) 單位：%

基質(zhì)效應(yīng)的消除可采取配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線或?qū)悠愤M(jìn)行其他前處理凈化等方式解決。鑒于GHB、1,4-BD和GBL的極性差異較大，分別為極性、弱極性、非極性化合物，因此，較難選擇合適的固相萃取小柱進(jìn)行凈化處理。同時，γ-丁內(nèi)酯在前處理過程中可隨水蒸氣揮發(fā)，因此，對于碳酸飲料和含酒精的飲料也不適合采用加熱除二氧化碳或除酒精后復(fù)溶的處理過程。考慮到飲料中若非法添加GHB、1,4-BD、GBL，根據(jù)不法分子的添加動機(jī)分析，其添加量不可能很低(因?yàn)镚HB在人體中本身就內(nèi)源性存在，添加量太少，對人體不起作用)，所以本研究最終選擇直接稀釋的方法進(jìn)行樣品處理以消除基質(zhì)效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)將樣品分別稀釋5倍、10倍、25倍及50倍進(jìn)行加標(biāo)回收，結(jié)果表明(圖5)，隨著稀釋倍數(shù)增加，GHB的基質(zhì)效應(yīng)顯著降低，但依然不高于50%；當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到25時，1,4-BD和GBL回收率均超過90%，基質(zhì)效應(yīng)可基本忽略。因此，在實(shí)際樣品檢測時，建議考慮按照1.1配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以消除不同基質(zhì)對質(zhì)譜中GHB響應(yīng)信號的影響。考慮到方法檢出限、儀器響應(yīng)等情況，最終將稀釋倍數(shù)定為25倍。

圖5 不同稀釋倍數(shù)下GHB(a)、1,4-BD(b)、GBL(c)加標(biāo)回收率%Fig.5 The recovery of GHB(a), 1, 4-BD(b) and GBL(c) of different dilution multiple

2.3.4 線性關(guān)系和檢出限

配制一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在2.2的儀器分析條件下進(jìn)行測定，得出3種物質(zhì)在0.5～10.0 μg/mL呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，檢出限(RSN=3)均為0.5 μg/mL。3種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表4。

表4 GHB、1,4-BD、GBL的線性范圍、校準(zhǔn)曲線 方程和相關(guān)系數(shù)Table 4 Linear range, calibration curve equation and correlation coefficient of GHB, 1, 4-BD and GBL

2.3.5 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.2的儀器條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定各自的峰面積，以峰面積為對象，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)品峰面積RSD小于0.10%，保留時間RSD小于1.0%，表明該方法精密度良好。

平行制備同一濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品6份，按2.2的儀器條件進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積和保留時間為對象，得出RSD值均小于1.5%，表明該測定方法的重復(fù)性良好。

準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在1.2的儀器條件下，分別在0、1、2、4、8、12、24、36、48 h進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積和保留時間為對象，得出RSD<2.0%，表明標(biāo)準(zhǔn)品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定，儀器穩(wěn)定性良好。

2.3.6 回收率

稱取同一樣品各3份，分別對樣品進(jìn)行3個水平的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個實(shí)驗(yàn)均6次重復(fù)，以不加混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的樣品作參照，并按照2.3方法制備供試品溶液，按2.2的儀器條件進(jìn)樣，根據(jù)測定的含量，計(jì)算其相應(yīng)的回收率，結(jié)果見表5。不含蛋白飲料GHB的回收率為81.1%～87.7%，RSD為3.8%～5.7%(n=6)，1,4-BD的回收率為98.5%～99.6%，RSD為4.4%～5.3%(n=6)，GBL的回收率為107.5%～113.6%，RSD為3.9%～5.1%(n=6)；含蛋白質(zhì)飲料GHB的回收率為82.6%～82.8%，RSD為3.3%～5.2%(n=6)，1,4-BD的回收率為98.7%～99.8%，RSD為3.7%～4.4%(n=6)，GBL的回收率為110.5%～116.2%，RSD為3.5%～4.6%(n=6)。結(jié)果表明上述實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度較高，能應(yīng)用于飲料中GHB、1,4-BD和GBL的檢測分析。

表5 GHB、1,4-BD、GBL的回收率(n=6)Table 5 The recovery of GHB, 1, 4-BD and GBL(n=6)

2.4 實(shí)際樣品檢測

采用所建立的方法對市售和網(wǎng)上購買的樣品(共40批次)進(jìn)行了檢測，結(jié)果如表6。

3 結(jié)論

本研究建立了飲料中GHB及其前體物質(zhì)1,4-BD和GBL的HPLC-MS/MS方法，其檢出限為0.5 μg/mL，該方法靈敏度高、簡便快速，可靠性高。應(yīng)用此方法，本研究檢測了40份樣品中GHB、GBL和1,4-BD的含量水平，檢驗(yàn)結(jié)果均為未檢出。本研究所建立的分析方法及研究結(jié)果能為實(shí)際檢測提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)支撐。

表6 市售和網(wǎng)購各類飲料中GHB、1,4-BD和GBL的測試結(jié)果Table 6 The result of GHB, 1, 4-BD and GBL in actual beverage samples

注：ND代表未檢出。