白酒難揮發(fā)組分中呈苦味三羥基十八烯酸的分離與鑒定

趙騰飛，陳雙，李華鐘，徐巖

(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物工程學(xué)院釀酒微生物與酶技術(shù)研究室，江蘇 無錫 214122)

白酒是我國獨(dú)具民族特色的蒸餾酒，其固態(tài)蒸餾的生產(chǎn)工藝不僅賦予白酒復(fù)雜的揮發(fā)性組分[1]，同時(shí)也能夠?qū)⒕契蟹肿恿枯^大的難揮發(fā)組分夾帶至酒體中[2-3]。豐富的揮發(fā)性組分和難揮發(fā)組分共同構(gòu)成了白酒的獨(dú)特風(fēng)味。

早期對(duì)白酒中化學(xué)成分的研究主要集中于揮發(fā)性組分的解析，通過氣相色譜-質(zhì)譜和全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜等技術(shù)的應(yīng)用，在白酒中已鑒定出超過1 000種揮發(fā)性組分[4]。而基于氣相色譜-聞香技術(shù)的應(yīng)用，進(jìn)一步明晰了這些揮發(fā)性組分在白酒中的風(fēng)味功能。目前已在不同香型白酒中鑒定出超過400種具有香氣功能的化合物，基本解析了不同香型白酒的關(guān)鍵風(fēng)味特征[5-7]。隨著研究的深入，對(duì)白酒的探索逐漸從揮發(fā)性組分?jǐn)U展至難揮發(fā)組分。鄭偉等人通過衍生化結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜首次分析了醬香、濃香和清香三大香型酒樣的難揮發(fā)化合物，共鑒定出16種醇、23種有機(jī)酸、16種酯和9種糖等化合物，并指出醬香型酒樣的難揮發(fā)組分最為復(fù)雜。但在該研究中，仍有大量色譜峰未能準(zhǔn)確定性[3]。楊會(huì)等人同樣使用衍生化結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜的方法針對(duì)白酒中的難揮發(fā)有機(jī)酸進(jìn)行了分析，共定性定量了27種有機(jī)酸[8]。張榮等人通過制備液相色譜結(jié)合核磁共振技術(shù)，首次在白酒中分離鑒定出分子質(zhì)量>1 000 u的脂肽類化合物[2]。這些研究表明白酒中存在豐富的難揮發(fā)組分，但由于難揮發(fā)組分中化合物的多樣性和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，對(duì)難揮發(fā)化合物的分離鑒定及風(fēng)味功能研究存在很大的挑戰(zhàn)。

白酒作為嗜好性酒精飲品，味覺和口感是決定其風(fēng)味質(zhì)量和消費(fèi)者偏好的重要指標(biāo)。一般而言，大多數(shù)呈味物質(zhì)具有難揮發(fā)性[9-10]，然而在白酒難揮發(fā)組分中，有關(guān)呈味化合物的分析卻鮮有報(bào)道。針對(duì)復(fù)雜食品基質(zhì)中具有呈味功能化合物的研究，德國HOFMANN教授團(tuán)隊(duì)建立了一套基于滋味稀釋技術(shù)的分析方法(taste dilution analysis，TDA)[11]，它能準(zhǔn)確且高效地鑒定食品中的關(guān)鍵呈味物質(zhì)。TDA方法主要原理是以人們的口腔感知為導(dǎo)向，結(jié)合高效液相色譜、凝膠色譜和高速逆流色譜等分離技術(shù)，從食品呈味組分中分離出關(guān)鍵呈味化合物，進(jìn)一步通過傅里葉紅外光譜、高分辨質(zhì)譜和核磁共振等技術(shù)對(duì)關(guān)鍵呈味化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。該方法已經(jīng)成功的鑒定出啤酒中[12]、清酒中的苦味化合物[13]和葡萄酒中的酸澀味化合物[14]等。

因此本研究針對(duì)白酒基質(zhì)，基于TDA技術(shù)建立白酒難揮發(fā)組分中呈味組分的提取分離和鑒定方法，解析白酒難揮發(fā)組分中具有呈味功能的化合物，有助于豐富對(duì)白酒中呈味物質(zhì)的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

甲醇、乙醇和甲酸均為色譜純，購買于Adamas-beta(中國上海)；2-羥基丙酸(CAS：50-21-5)和2-羥基-4-甲基戊酸(CAS：498-36-2)購買于Sigma-Aldrich(中國上海)；9,10,13-三羥基-11(E)-十八烯酸(CAS：29907-57-1)和9,12,13-三羥基-10(E)-十八烯酸(CAS: 29907-56-0)購買于Larodan Fine Chemicals(瑞典)；瓶裝水(中國杭州，哇哈哈)，用于感官品評(píng)；去離子水為Milli-Q超純水，用于儀器分離。實(shí)驗(yàn)中所用5%乙醇水溶液和1%甲酸水溶液中的百分?jǐn)?shù)均指體積分?jǐn)?shù)。

1.2 白酒樣品

醬香型白酒(醬香1，53%(vol)，由貴州某酒廠提供)，用于呈味物質(zhì)的分離鑒定。醬香型酒樣[醬香2，53%(vol)]、濃香型酒樣[濃香1、濃香2，52%(vol)]和清香型酒樣[清香1、清香2，52%(vol)]均為市售成品白酒，用于呈味物質(zhì)含量分析。所有酒樣都儲(chǔ)存于4 ℃以待分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士，Buchi)；冷凍干燥儀(美國，Labconco Corporation，4.5 L)；液相色譜儀(High Performance Liquid Chromatography，日本，Shimadzu，LC-20A)；超高效液相色譜儀-三重四極桿質(zhì)譜儀(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS，美國，Waters，XEVO)；高分辨質(zhì)譜儀(high resolution mass spectrometry，HRMS，美國，Thermo Fisher，Q Exactive)；核磁共振儀(nuclear magnetic resonance，NMR，德國，Bruker，AVANCE III)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 難揮發(fā)組分的收集

使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)白酒樣品進(jìn)行分離(具體使用的酒樣量分別在結(jié)果與分析中列出)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀水浴溫度為40 ℃，真空度-0.1 MPa。當(dāng)蒸發(fā)瓶中的酒樣<10 mL時(shí)，停止蒸發(fā)，收集難揮發(fā)組分。使用冷凍干燥儀器對(duì)難揮發(fā)組分進(jìn)行凍干處理，將凍干后的樣品儲(chǔ)存于-20 ℃以待分析。

1.4.2 難揮發(fā)組分的固相萃取分離

將難揮發(fā)組分溶解至5%乙醇水溶液中，稀釋后裝載至C18固相萃取柱(柱體積60 mL，填料10 g；上海，安譜)。收集不被柱子保留的組分(F1)，被柱子保留的組分依次使用20%、40%、60%、80%和100%的甲醇水溶液進(jìn)行洗脫，收集相對(duì)應(yīng)的組分(F2～F6)。所有組分進(jìn)行去溶劑凍干處理，并儲(chǔ)存于-20 ℃以待分析。

1.4.3 HPLC分離

將得到的組分F4溶解于甲醇，組分F1溶解于水溶液。使用HPLC分別對(duì)它們進(jìn)行分離。流動(dòng)相為1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，流速為2 mL/min，紫外吸收波長(zhǎng)225 nm。組分F4的洗脫梯度：Water C18色譜柱(5 μm，10 mm×250 mm)，0 min，A/B(70∶30)，3 min，A/B(70∶30)，40 min，A/B(0∶100)，45 min，A/B(0∶100)。組分F1的洗脫梯度：Waters苯基色譜柱(5 μm，10 mm×250 mm)，0 min，A/B(95∶5)，10 min，A/B(95∶5)，12 min，A/B(80∶20)，15 min(80∶20)。按照色譜峰將組分F4和F1分成若干亞組分，收集這些亞組分并對(duì)其進(jìn)行去溶劑和凍干處理，之后儲(chǔ)存于-20 ℃以待分析。

將組分F4-7溶解于甲醇，使用Waters苯基柱將組分F4-7繼續(xù)分離，流動(dòng)相為含1%的甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，流速為2 mL/min，紫外吸收波長(zhǎng)225 nm。洗脫梯度：0 min，A/B(55∶45)，35 min，A/B(45∶55)，40 min，A/B(0∶100)，45 min，A/B(0∶100)。按照色譜峰將組分F4-7再次分成若干亞組分，收集這些亞組分并對(duì)其進(jìn)行去溶劑和凍干處理，之后儲(chǔ)存于-20 ℃以待分析。

1.4.4 TDA分析

具體TDA實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[11]，將2 L酒樣醬香1的難揮發(fā)組分通過HPLC分離，收集得到的組分，凍干后，溶解至2 mL 5%乙醇水溶液中，按照1∶1(體積比)的比例逐步用5%乙醇水溶液稀釋。每個(gè)組分按照稀釋倍數(shù)從高至低分配至感官品評(píng)人員進(jìn)行品評(píng)，每個(gè)稀釋倍數(shù)的溶液都需要進(jìn)行三點(diǎn)檢驗(yàn)。當(dāng)品評(píng)人員剛好能分辨出某個(gè)稀釋水平與其它兩個(gè)空白樣品中(5%乙醇水溶液)的差異時(shí)，則記錄此稀釋倍數(shù)為該組分的稀釋值(TD值)。每個(gè)組分的TD值取自12個(gè)品評(píng)員品評(píng)結(jié)果的平均值。每個(gè)組分的TD值的誤差不超過1個(gè)稀釋水平。

1.4.5 呈味化合物結(jié)構(gòu)鑒定

采用HRMS和NMR對(duì)通過TDA得到的關(guān)鍵呈味組分F4-7/5、F1-2和F1-3和進(jìn)行分析，鑒定其中的呈味物質(zhì)。具體分析結(jié)果如下:

2-羥基丙酸(3，圖3-A2)。HRMS(ESI-)：測(cè)量值89.0232([M-H]-)，計(jì)算值C3H5O3，誤差-1.4 ppm。MS/MS(m/z%)：89.0232(40)，43.0178(100)。

2-羥基-4-甲基戊酸(4，圖3-A3)。HRMS(ESI-)：測(cè)量值131.0705([M-H]-)，計(jì)算值C6H11O3，誤差1.7 ppm；MS/MS(m/z%)：131.0701(93)，113.0595(3)，86.0678(7)，85.0645(100)，69.0331(3)。

1.4.6 呈味化合物定量分析

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。配制化合物1和2的標(biāo)準(zhǔn)品的工作液，每個(gè)化合物配制7個(gè)質(zhì)量濃度的工作液，化合物1和2的濃度范圍是10～1 000 μg/L。使用UPLC-MS/MS測(cè)量每個(gè)質(zhì)量濃度工作液所對(duì)應(yīng)的色譜峰面積，并制作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。質(zhì)譜采用陰離子模式下的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)進(jìn)行測(cè)量。具體質(zhì)譜參數(shù)為：離子源溫度120 ℃，去溶劑溫度450 ℃，毛細(xì)管電壓0.6 kV，錐孔電壓3 V，錐孔氣流0.25 mL/min，去溶劑氣流1 100 L/h。每個(gè)濃度測(cè)量6次，計(jì)算方法精密度。在測(cè)試回收率時(shí)，將確定含量的標(biāo)準(zhǔn)化合物加入酒樣中，進(jìn)行前處理后，測(cè)試濃度。具體計(jì)算方法：

取50 mL酒樣，除去揮發(fā)性組分，將剩余難揮發(fā)組分裝載至C18固相萃取柱，依次使用體積分?jǐn)?shù)為20%和100%的甲醇水溶液洗脫，并收集100%甲醇洗脫下的組分。對(duì)該組分進(jìn)行凍干處理。定量呈味物質(zhì)1和2的濃度時(shí)，將各組分溶解于甲醇，稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)，經(jīng)過0.45 μm膜過濾后，使用UPLC-MS/MS進(jìn)行分析，每個(gè)樣品測(cè)試3次。

使用BEH C18色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行分離，流動(dòng)相為1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)。洗脫梯度：流速0.3 mL/min，0 min A/B(70∶30)，1 min A/B(70∶30)，10 min A/B(0∶100)，11 min A/B(70∶30)，12 min A/B(70∶30)。

1.4.7 感官品評(píng)

感官品評(píng)方法參照HOFMANN等人文獻(xiàn)[11]。挑選12個(gè)從事白酒品評(píng)2年以上的人員(6男、6女，年齡25～35)建立感官品評(píng)小組。為了分析難揮發(fā)酒樣中的呈味物質(zhì)，使用5種基本味覺(酸、甜、苦、咸、鮮)所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)品評(píng)人員進(jìn)行再次培訓(xùn)。感官品評(píng)采用吞吐(sip-and-spit)的品評(píng)方式，安全起見，品評(píng)人員在品評(píng)樣品后必須將樣品吐出，不允許吞咽樣品。在品評(píng)過程中，為了防止香氣化合物的影響，品評(píng)人員必須佩帶鼻夾。

味覺強(qiáng)度的測(cè)定：在品評(píng)酒樣醬香1難揮發(fā)組分和其固相萃取分離組分的味覺強(qiáng)度時(shí)，將分離后的各組分溶解于2 mL 5%乙醇水溶液中，通過吞吐法品評(píng)樣品并對(duì)其按照0(沒有味覺)～5(能強(qiáng)烈感知)的強(qiáng)度級(jí)別進(jìn)行打分。最終味覺強(qiáng)度取自12個(gè)品評(píng)員品評(píng)結(jié)果的平均值。

1.4.8 HRMS分析

使用HRMS對(duì)經(jīng)過HPLC分離后的組分進(jìn)行分析。將凍干后的呈味組分F4-7/5、F1-2和F1-3溶解2 mL甲醇中，濃度約為1 mg/L，經(jīng)過0.45 μm膜過濾后直接進(jìn)樣分析。質(zhì)譜使用陰離子全掃模式，掃描質(zhì)量范圍是10～800 u，分辨率為70 000 50%峰寬。數(shù)據(jù)使用Thermo Fisher Xcalibur軟件進(jìn)行分析。

1.4.9 NMR分析

使用NMR(400 MHz)對(duì)HPLC分離后的組分進(jìn)行分析，溫度為30 ℃。處理10 L醬香1，得到凍干后的組分F4-7/5約4 mg。根據(jù)溶解性，將樣品溶解至500 μL CD3OD中并裝入核磁管進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)得到數(shù)據(jù)使用MestReNova V6.1進(jìn)行分析。

1.4.10 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2013軟件對(duì)在6中酒樣中檢測(cè)得到的呈味化合物濃度進(jìn)行單因素方差分析(p<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬香型酒樣中難揮發(fā)組分的感官特征分析

在醬香、濃香和清香3大香型白酒中，醬香型白酒的難揮發(fā)組分最為復(fù)雜[3]。因此，本研究選用醬香型酒樣進(jìn)行分析。為了解析醬香型酒樣中難揮發(fā)組分的感官特征，對(duì)50 mL酒樣采用減壓蒸餾和冷凍干燥技術(shù)除去揮發(fā)性組分，對(duì)剩余的難揮發(fā)組分進(jìn)行感官品評(píng)。感官分析表明難揮發(fā)組分具有明顯的苦味和酸味特征，其味覺強(qiáng)度分別為2.2和4.0(表1)。這2種味覺都是白酒重要的風(fēng)味特征，微量苦味可以豐富白酒的風(fēng)味[15]，適量酸味能夠使白酒具有醇厚感[16]。為了解析難揮發(fā)組分中的苦味和酸味物質(zhì)，以感官為導(dǎo)向，通過多級(jí)分離技術(shù)從難揮發(fā)組分中篩選出關(guān)鍵呈味組分，以進(jìn)行后期結(jié)構(gòu)鑒定。具體實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.1 Experiment scheme of this study

首先采用C18固相萃取柱按照化合物的極性對(duì)難揮發(fā)組分進(jìn)行預(yù)分離，并對(duì)得到的組分進(jìn)行感官品評(píng)。結(jié)果顯示疏水性組分F4的苦味強(qiáng)度分別為2.0，親水性組分F1的酸味強(qiáng)度為3.9；其他組分的味覺強(qiáng)度較弱或者無明顯滋味(表1)。因此，將重點(diǎn)分析F4和F1這兩個(gè)組分。

注：a難揮發(fā)組分由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀分離制備，F(xiàn)1～F6為通過固相萃取分離后的組分；b得率通過稱重獲得，每個(gè)值測(cè)量3次取平均值；c苦味和酸味強(qiáng)度的品評(píng)值由12個(gè)品評(píng)人員評(píng)定，品評(píng)范圍0(無明顯味覺)～5(強(qiáng)烈感知)。

2.2 苦味組分F4的二級(jí)HPLC-TDA分析

采用UPLC-MS通過離子全掃模式對(duì)組分F4和F1進(jìn)行初步檢測(cè)，分析結(jié)果顯示這2個(gè)組分非常復(fù)雜。為了分析組分F4和F1中的呈味化合物，對(duì)2 L醬香1酒樣進(jìn)行固相萃取分離并得到相應(yīng)的組分F4和F1，使用HPLC對(duì)這2個(gè)組分進(jìn)行進(jìn)一步分離，結(jié)合TDA篩選出關(guān)鍵呈味組分。

首先使用C18色譜柱分離具有苦味特征的組分F4。感官品評(píng)分離后的組分得出，F(xiàn)4-7的TD值為8，其它組分的TD值均≤1(圖2-A)。說明F4-7是難揮發(fā)組分中的主要苦味組分。但使用UPLC-MS分析后發(fā)現(xiàn)該組分仍含有多個(gè)離子，比較復(fù)雜，需要二級(jí)HPLC分離。

圖2 苦味組分F4和的二級(jí)HPLC-TDA分析(A、B)以及F4-7/5的高分辨質(zhì)譜分析(C)[9,10,13-三羥基-11(E)-十八烯酸(1)和9,12,13-三羥基-10(E)-十八烯酸(2)]Fig.2 Two-dimensional HPLC-TDA analysis of bitter-tasting fraction F4 (A,B) and HRMS analysis of fraction F4-7/5 (C)[9,10,13-trihydroxyoctadec-11(E)-enoic acid (1) and 9,12,13-trihydroxyoctadec-10(E)-enoic acid (2)]

使用苯基色譜柱對(duì)組分F4-7進(jìn)行二級(jí)分離。在得到的組分中，僅有組分F4-7/5的TD值最高，其它組分雖有較強(qiáng)的色譜峰，但其TD均≤1(圖2-A)。再次使用UPLC-MS分析后可知該組分所含主要離子是329 [M-H]-，可進(jìn)行定性分析。

使用HRMS分析苦味組分F4-7/5，結(jié)果顯示其所含離子的精確分子質(zhì)量為329.2333 [M -H]-，對(duì)應(yīng)元素組成是C18H34O5(不含陰離子)。分析該化合物的二級(jí)質(zhì)譜信息，在子離子碎片中，有連續(xù)的H2O缺失(329、311、293，圖2-C)，結(jié)合不飽和度(RDB=2)，可知該化合物可能含有羥基和羧基。通過Scifinder搜索具有這些結(jié)構(gòu)信息的化合物并進(jìn)行比對(duì)[17]，初步推測(cè)該組分中的化合物是一對(duì)互為同分異構(gòu)體的三羥基十八烯酸。采用NMR技術(shù)進(jìn)一步分析該化合物的結(jié)構(gòu)特征。在13C譜中，可以明確解析出一個(gè)羧基碳(δ 176.4)，3個(gè)與羥基相連的碳(δ 71.7、74.3和75.4)和1對(duì)雙鍵碳(δ 129.6 和136.3)。同樣在1H譜中也可以分辨出這些基團(tuán)所對(duì)應(yīng)的氫。并且，在雙鍵dd峰中的偶合常數(shù)為J=13.2，說明該雙鍵是反式。最后，結(jié)合質(zhì)譜信息確定羥基和雙鍵的位置，并通過標(biāo)準(zhǔn)品的比對(duì)，鑒定出這一對(duì)同分異構(gòu)體為9,10,13-三羥基-11(E)-十八烯酸(1)和9,12,13-三羥基-10(E)-十八烯酸(2，圖2-A3)。文獻(xiàn)報(bào)道這類三羥基脂肪酸是亞油酸的氧化產(chǎn)物[18]，具有典型的苦味特征，在多種食品中被檢測(cè)到，對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味具有重要影響[19-21]。亞油酸也是釀酒原料高粱中最主要的不飽和脂肪酸[22]，推測(cè)這類物質(zhì)可能源于高粱中亞油酸的氧化分解。

2.3 酸味組分的HPLC-TDA分析

對(duì)酸味組分F1使用苯基柱分離，感官品評(píng)分離后的組分可知，F(xiàn)1-2和F1-3有明顯的酸味，TD值分別是512和8，其他組分TD值均≤1(圖3-A)。由此說明這2個(gè)組分是關(guān)鍵呈味組分，經(jīng)過UPLC-MS分析可知組分F1-2和F1-3所含的主要離子分別是89和131 [M-H]-，可進(jìn)行定性分析。

使用HRMS分析酸味組分F1-2和F1-3，結(jié)果顯示它們所含主要離子的精確分子質(zhì)量分別為89.023 2和131.070 5 [M-H]-，對(duì)應(yīng)的元素組成分別為C3H6O3和C6H12O3(不含陰離子)。從分子式的不飽和度和含氧元素的個(gè)數(shù)分析，這2個(gè)化合物應(yīng)該含有羥基和羧基。結(jié)合之前對(duì)白酒有機(jī)酸類化合物的分析[8]，推測(cè)這2種化合物分別為2-羥基丙酸(乳酸，3，圖3-B)和2-羥基-4-甲基戊酸(4，圖3-C)，再通過與標(biāo)準(zhǔn)品的比對(duì)，確定了它們的結(jié)構(gòu)。雖然，在白酒難揮發(fā)組分中有多種有機(jī)酸[8]，但本研究通過TDA證明了化合物3和4是難揮發(fā)組分中最主要的兩種呈味酸。

圖3 酸味組分F1(A)的HPLC-TDA分析以及組分F1-2(B)和F1-3(C)的高分辨質(zhì)譜分析[乳酸(3)和2-羥基-4-甲基戊酸(4)]Fig.3 HPLC-TDA analysis of sour-tasting fraction F1 (A) and HRMS analysis of fraction F1-2 (B) and F1-3 (C) [lactic acid (3) and 2-hydroxy-4-methylpentanoic acid (4)]

2.4 白酒中三羥基脂肪酸的含量分析

對(duì)在白酒中首次鑒定出的化合物1和2，采用UPLC-MS/MS技術(shù)通過MRM模式建立它們的定量方法。雖然化合物1和2互為同分異構(gòu)體，但結(jié)構(gòu)差異使它們具有不同的二級(jí)質(zhì)譜信息(圖2-C)。根據(jù)子離子碎片選擇相應(yīng)的定量離子，以實(shí)現(xiàn)對(duì)它們的分別定量分析?；衔?對(duì)應(yīng)的定量離子為m/z329→201，標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)是y=12.87x-16.06(x：μg/L)，R2=0.998；化合物2對(duì)應(yīng)的定量離子為m/z329→199，y=10.63x+15.33(x：μg/L)，R2=0.997?；衔?和2定量方法的精密度分別為5.4%和6.4%，回收率分別為93.7%和91.6%。精密度和準(zhǔn)確性良好，可以進(jìn)行定量分析。

為了分析化合物1和2的在白酒中的含量分布，選擇其他醬香、濃香和清香型的酒樣進(jìn)行對(duì)比(表2)。結(jié)果顯示，化合物1和2在醬香、濃香和清香共6種酒樣中均存在，濃度范圍分別為1.8～265.3和2.2～111.3 μg/L。但它們?cè)?種酒樣中的濃度具有顯著性差異(p<0.01)，且在醬香型白酒中質(zhì)量濃度最高，僅有化合物2在2種清香型酒樣中的濃度無顯著性差異。

表2 苦味化合物1和2a 在不同酒樣中的含量b 單位：μg/L

注：a每個(gè)編號(hào)對(duì)應(yīng)的化合物見圖2；b同列不同的大寫字母表示有顯著性差異(p<0.01)。

3 結(jié)論

本研究采用TDA技術(shù)分析白酒難揮發(fā)組分中的呈味物質(zhì)。通過以感官強(qiáng)度為導(dǎo)向，結(jié)合固相萃取和多級(jí)HPLC分離，從醬香型酒樣的難揮發(fā)組分中篩選并分離出關(guān)鍵呈味化合物，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。采用HRMS技術(shù)鑒定出了酸味化合物乳酸和2-羥基-4-甲基戊酸。采用HMRS結(jié)合NMR技術(shù)首次從白酒中鑒定出具有苦味特征的化合物9,10,13-三羥基-11(E)-十八烯酸和9,12,13-三羥基-10(E)-十八烯酸，并建立了其在白酒中的精確定量方法。文獻(xiàn)報(bào)道三羥基十八烯酸是亞油酸的氧化產(chǎn)物，而亞油酸是釀酒原料高粱中最主要的不飽和脂肪酸，因此推測(cè)白酒中的三羥基十八烯酸可能源于高粱中亞油酸的氧化分解。此外，有關(guān)白酒中脂肪的代謝產(chǎn)物及其對(duì)風(fēng)味的影響也值得關(guān)注和進(jìn)一步研究。