羊火腿風干成熟期間蛋白質、脂肪氧化以及相互影響

木卡代斯·木合旦爾，決肯·阿尼瓦什，巴吐爾·阿不力克木*

1(新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊,830052) 2(新疆農業大學 動物科學學院，新疆 烏魯木齊,830052)

干腌羊火腿是世界各地國家人民喜愛的肉類產品之一。新疆羊火腿借鑒阿拉伯地區羊火腿加工方法，結合新疆少數民族飲食習慣，腌制、風干、成熟而制成的腌臘肉制品。羊火腿的加工過程包括：原料羊腿的選用→修腿→腌制→清洗→風干成熟→包裝等工序。火腿的成熟發生在整個風干過程[1]，風干成熟期間，肌肉蛋白質經歷一系列的物理化學變化影響其穩定性，從而導致火腿的營養和感官特性變化。

肌肉組織中富含亞鐵血紅素、不飽和脂肪酸、金屬催化劑等促氧化因子。因此，在肉類宰后成熟、加工、運輸及貯藏過程中，肌肉組織極易被氧自由基攻擊[2]。蛋白質氧化引起蛋白質構象和功能的變化以及共價分子間交聯蛋白衍生物的形成，肽鍵的切割和氨基酸側鏈的修飾(羰基化)(疏基化)等[3-7]。羰基化合物的形成是在蛋白質氧化過程發生的最明顯的變化之一[8-9]，通常作為評價蛋白質氧化(P-OX) 程度的指標[10]。蛋白質羰基化的形成是特定氨基酸殘基發生反應以及金屬催化氧化的結果，鐵以及肌紅蛋白被認為肉類體系中蛋白質羰基化的主要貢獻者[4]。適度的蛋白質氧化有助于提高肉的成熟度，但肌肉蛋白質在成熟過程過度氧化，導致肌肉色澤、風味、保水性及質構特性的惡化、肌肉嫩度的下降以及必需氨基酸的損失等不良后果。

肉制品中的脂肪主要由甘油酯、磷脂和游離脂肪酸三部分組成，其中游離脂肪酸含量所占的比例最小。根據氧化機理的不同，脂肪氧化分為酶促氧化和非酶促氧化。酶促氧化是原料在脂肪酶作用下脂肪氧化成游離脂肪酸、多不飽和脂肪酸，進一步被脂肪酶氧化而生成氫過氧化物[11]。臘肉的酶促氧化主要是脂肪氧合酶催化不飽和脂肪酸的反應[12]，脂質氧化所產生的低分子化合物有助于火腿風味物質的形成。許多研究表明，食品中NaCl含量、加工儲藏溫度會影響脂質氧化[13-14]，脂肪氧化嚴重導致羊火腿顏色的惡化，臭味影響羊火腿的感官品質。

本實驗通過測定羊火腿風干成熟期間蛋白質氧化、脂肪氧化和相互影響，以及羊火腿風干成熟期間色度的變化與蛋白質氧化、脂肪氧化的相關性分析，為改善羊火腿產品品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用宰后24 h以內的鮮羊腿12條，每條羊腿重量為 2.5～3 kg，由烏魯木齊市沙依巴克區新朱蘭清牛羊肉配送中心提供；食鹽、亞硝酸鹽、蔗糖、調料等，由市場購置。

濃H2SO4，H3BO3，KCl，K3PO4，MgCl2，疊氮化鈉，牛血清蛋白，三氯乙酸，HCl，2,4二硝基苯肼，乙醇，乙酸乙酯，鹽酸胍，尿素緩沖液，1,1,3,3-四乙氧基丙烷。

1.2 儀器與設備

索氏提取器,JA2003max200型分析天平,上海上天精密儀器有限公司；GL-20GⅡ低溫離心機,上海安亭科學儀器廠；H18399型高速均漿機,北京恒奧德儀器儀表有限公司；HH-S4型數顯恒溫水浴鍋,金壇市醫療儀器廠；JZ-350便攜式色彩色差儀,蘇州艾森儀器設備有限公司；721型紫外可見分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司；DHG-3923A電熱恒溫干燥箱,上海恒科技機器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羊火腿的制作

加工工藝：

原料羊腿的選用→修腿→腌制→清洗→風干前期→風干中期→風干后期→成熟期。

工藝條件：將預處理之后的原料羊腿按腌制料配比用食鹽5%、硝酸鹽0.2%、蔗糖0.5%，在溫度4～8 ℃，濕度85%～90%條件下腌制3 d；風干前期：5 d(10～12 ℃、濕度80%～85%、風速0.8 m/s)；風干中期：7 d(10～12 ℃、濕度75%～80%、風速0.8 m/s)；風干后期：8 d(14～15 ℃、濕度75%～85%、風速0.8 m/s)；成熟期：7～10 d(16～18 ℃、濕度70%～75%、風速0.5 m/s)；取樣點分別為原料羊腿(第0天)、腌制結束期(第3天)、風干前期(第8天)、風干中期(第15天)、風干后期(第23天)、成熟期(第30天)總共取6次樣，放置 -20 ℃ 冷凍保藏，檢測時解凍使用。

1.3.2 總氮含量的測定

凱氏定氮法。

1.3.3 脂肪含量的測定

索氏提取法。

1.3.4 羊火腿風干成熟期間蛋白質氧化的測定

1.3.4.1 肌原纖維蛋白的提取

將肉羊剪碎研磨后，取去除筋腱和結締組織后的肉樣10 g ，加入8倍體積的標鹽溶液，用高速均漿機勻漿10 s，離心(1 000×g，10 min)，棄上清液，沉淀按上述操作重復離心3次，棄上清液，沉淀中加入6倍體積的含有曲拉通X-100標準鹽溶液勻漿，離心(2 000×g，5 min)2次。沉淀中加入5倍體積的標準鹽溶液，(10 000×g，10 min)低溫離心，重復2次。用6倍體積的100 mol/mL的KCl降速離心2次，用5倍體積的100 mol/mL的NaCl洗滌2次，得到的肌原纖維蛋白，用考馬斯亮藍法測定濃度，采用牛血清蛋白作為標準蛋白。

1.3.4.2 羰基含量的測定

參照OLIVER[15]和GANHO[16]的方法并做修改，取2份0.2 mL的質量濃度為10 mg/mL的蛋白質溶液，放入2 mL的離心管中，用4 ℃的1 mL 20 g/L的三氯乙酸溶液沉淀蛋白質，620×g離心5 min，對照組用1 mL 2 mol/L的HCl處理，待測組加入等量體積的2 g/L的DNPH，室溫放置1 h。用1 mL 20 g/L的TCA沉淀樣品，用1 mL的乙醇和乙酸乙酯混合液(體積比1∶1)洗滌2次以除去過量的DNPH，將沉淀溶解于含有6 mol/L鹽酸胍、120 mol/L (pH 6.5)的磷酸鈉緩沖液中，攪拌并620×g離心3 min除去不溶性物質。在370 nm波長下測定溶液的吸光度值，羰基含量表示為nmol DNPH/mg，蛋白質腙的吸收系數為21.0 nmol/L·cm。

1.3.4.3 總巰基含量的測定

將蛋白液稀釋至2 mg/mL，與尿素緩沖液按1∶1比例溶解，孵育后加入0.5 mL DTNB試劑，在室溫下反應 15 min，在λ為412 nm處測吸光度。空白組加入0.5 mL 不含DTNB的緩沖液。巰基含量(nmol/mg蛋白質)使用摩爾吸光系數11 400 mol/L·cm計算。每組樣品測量3個平行，結果取平均值。

1.3.5 羊火腿風干成熟期間脂質氧化的測定

1.3.5.1 硫代巴比妥酸的測定

1.3.5.2 過氧化值的測定

按 GB/T5009.37—2008 的方法測定。

1.3.6 色度的測定

將肉羊切成切面平整，圓柱形盛放器一樣大的薄片，隨機選擇3個位置進行測定。顏色指數：L*(亮度)，a*(紅度)和b*(黃度)。

C(彩色值)=(a*2+b*2)0.5

(1)

(2)

1.3.7 數據分析

用SPSS 18.0統計軟件進行方差分析以及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 羊火腿風干成熟期間總氮含量變化

羊火腿風干成熟期間總氮含量變化見圖1。

圖1 羊火腿風干成熟期間總氮含量的變化Fig.1 Changes in total nitrogen content during drying maturation process of dry cured sheep ham注：不同小字母表示羊火腿風干成熟期間總氮含量變化差異顯著(p<0.05),大寫字母表示變化差異極顯著 (p<0.01)。

由圖1可知，羊火腿在風干成熟期間總氮含量呈先下降后上升的趨勢，腌制結束3 d的總氮含量最低(8.15%)差異顯著(p<0.05)，原因可能是腌制過程中水溶性蛋白隨鹽水滲出而析出導致蛋白質含量的下降。在后續加工過程蛋白質含量逐漸上升，這與大部分腌臘肉制品風干過程總氮含量變化趨勢一致。

2.2 羊火腿風干成熟期間脂肪含量變化

羊火腿風干成熟期間脂肪含量變化見圖2。

圖2 羊火腿風干成熟期間脂肪含量的變化Fig.2 Changes in fat content during drying maturation process of dry cured sheep ham注：不同小字母表示羊火腿風干成熟期間脂肪含量變化差異顯著(p<0.05),大寫字母表示變化差異極顯著 (p<0.01)。

由圖2可知，羊火腿在風干成熟期間脂肪含量呈上升趨勢，風干期間脂肪含量差異不顯著(p<0.01)，風干后期和成熟期的差異不顯著(p>0.05)，風干成熟期間水分含量的下降，導致干物質含量上升，因此也導致脂肪含量上升。研究結果與郭黎洋[18]山羊火腿總脂肪含量變化趨勢一致。

2.3 羊火腿風干成熟期間蛋白質氧化情況

2.3.1 羊火腿風干成熟期間羰基含量變化

羊火腿風干成熟期間羰基含量變化見圖3。

圖3 羊火腿風干成熟期間羰基含量的變化Fig.3 Changes in Carbonyl Content during drying maturation process of dry cured sheep ham注：不同小字母表示羊火腿風干成熟期間羰基含量變化差異顯著(p<0.05),大寫字母表示變化差異極顯著 (p<0.01)。

蛋白質作為生物體的重要組成部分，普遍存在于細胞內外，極易被氧自由基攻擊，肌肉蛋白質氨基酸側鏈的氧化導致羰基產物積累。相關研究顯示，羰基含量隨著氧化程度的增加而增加[19-20]。由圖3得知，羊火腿風干成熟期間羰基含量由原料羊腿的1.07 nmol/mg蛋白(p<0.05)至成熟期30 d的4.72 nmol/mg蛋白(p<0.05)，呈先上升后下降的趨勢，該結果說明在羊火腿風干成熟期間活性氧自由基使羊火腿蛋白質的氨基酸側鏈NH—或NH2—基團部分轉化為羰基基團，導致羰基含量隨著蛋白質氧化程度的增大而上升。腌制結束3 d和風干前期8 d的羰基含量差異顯著(p<0.05)，原因可能是腌制結束后，羊腿的鹽含量的上升破壞細胞膜的完整結構，導致蛋白質分子結構疏松，易受活性基團的攻擊。

2.3.2 羊火腿風干成熟期間總巰基含量變化

羊火腿風干成熟期間總巰基含量變化見圖4。

肉制品中的蛋白質氧化可直接由活性氧和活性氮或間接由二級氧化產物誘導發生[21]。肌球蛋白是原纖維蛋白的主要組成蛋白，占肌原纖維蛋白的50%，肌球蛋白分子疏基量約有42個，肌動蛋白的疏基量約有12個，半胱氨酸結構中的巰基是肌原纖維蛋白中反應活性最強的功能基團，蛋白質氧化導致巰基含量的變化。由圖4得知，羊火腿風干成熟期間巰基含量從原料羊腿的42.06 nmol/mg至成熟期30 d的24.24 nmol/mg,呈下降趨勢，各階段差異顯著(p<0.05)。此結果表明，羊火腿風干成熟期間肌原纖維空間結構受到氧化因子的破壞，導致內部易氧性疏基的暴露，以及疏基含量的下降，此結果進一步地確認羊火腿風干成熟期間蛋白質氧化的存在以及不同的風干階段氧化程度的變化。

圖4 羊火腿風干成熟期間巰基含量的變化Fig.4 Changes in mercapto content during drying maturation process of dry cured sheep ham注：不同小字母表示羊火腿風干成熟期間巰基含量變化差異顯著(p<0.05),大字母表示變化差異極顯著 (p<0.01)。

2.4 羊火腿風干成熟期間脂肪氧化情況

2.4.1 羊火腿風干成熟期間硫代巴比妥酸的變化

羊火腿風干成熟期間硫代巴比妥酸的變化見圖5。

圖5 羊火腿風干成熟期間丙二醛含量的變化Fig.5 Changes in Malondialdehyde Content during drying maturation process of dry cured sheep ham注：不同小字母表示羊火腿風干成熟期間丙二醛含量變化差異顯著(p<0.05),大字母表示變化差異極顯著 (p<0.01)。

脂肪氧化過程中產生的氫過氧化物進一步分解為低分子的醛、酮等風味物質，其中丙二醛(MDA)與α-硫代巴比妥酸(TBA)試劑反應形成紅色的復合物，因此通過檢測丙二醛含量的變化能表現出脂肪氧化程度。由圖5得知，羊火腿風干成熟期間，丙二醛含量呈上升趨勢，丙二醛含量由原料腿的0.06 mg/kg至風干前期8 d的0.09 mg/kg，快速上升，差異顯著(p<0.05)。ZHOU等[22]發現鹽對肉制品減緩蛋白水解和脂肪分解的作用，但對干腌火腿促進脂質氧化的作用，通過研究羊火腿腌制結束的丙二醛含量變化也得出相似的結論。風干中期15 d丙二醛含量有所下降，原因可能是不穩定的丙二醛被降解成揮發性化合物或與蛋白質的游離氨基酸進行反應。

2.4.2 羊火腿風干成熟期間過氧化值的變化

羊火腿風干成熟期間過氧化值的變化見圖6。

圖6 羊火腿風干成熟期間過氧化值的變化Fig.6 Changes in POV Content during drying maturation process of dry cured sheep ham注：不同小字母表示羊火腿風干成熟期間過氧化值變化差異顯著(p<0.05),大字母表示變化差異極顯著 (p<0.01)。

在風干時間以及加工條件的影響下，脂肪氧化形成多種過氧化物。過氧化值是脂肪氧化一級產物，衡量脂肪氧化的重要指標，過氧化值高說明脂肪氧化中間產物積累的多，但這些過氧化物隨著積累很快進入下一步氧化反應生成醛、酮、酸等低分子物質[23-24]，因此隨著加工時間的延長，過氧化物逐漸分解。由圖6得知，羊火腿在風干成熟期間風干條件等因素的影響下過氧化值從原料羊腿的0.75 mep/kg至風干前期8 d的7.92 mep/kg,逐漸上升，各階段差異顯著(p<0.05)，風干中期15 d的9.47 mep/kg的至成熟期30 d的8.39 mep/kg，慢慢下降，各階段差異顯著(p<0.05)，原因可能是羊火腿風干成熟期間積累氫過氧化物，隨著風干時間生成醛、酸、酮等物質導致過氧化物質的減少。

2.5 羊火腿風干成熟期間色度的變化

肌肉顏色變化主要取決于肌肉肌紅蛋白和血紅蛋白的含量變化[4]。影響肉制品顏色的因素有原料肉的品種、肌肉種類、性別、飼料狀況、加工方式和條件、加工過程所添加的輔料類型和配比、蛋白質水解、脂肪和蛋白質氧化程度等。由表1得知，羊火腿風干成熟期間亮度先上升后下降，變化趨勢跟蛋白質氧化趨勢一致。紅度從原料羊腿至腌制結束3 d呈下降趨勢(p<0.05)，從風干前期8 d至成熟期30 d逐漸回升(p>0.05)，原因可能是肌紅蛋白的氧化導致火腿紅度的下降，后續加工過程隨著火腿的成熟，肌肉組織會形成紅色亞硝酰基肌紅蛋白[25]，因此羊火腿的紅度逐漸回升。羊火腿風干成熟期間黃度的變化不明顯，原料羊腿和成熟期30 d的黃度值差異不顯著(p>0.05)，腌制期3 d至風干后期23 d差異不顯著(p>0.05)。

表1 羊火腿風干成熟期間色度的變化Table 1 Changes in color during drying maturation process of dry cured sheep ham

注：不同字母表示羊火腿腌制、風干期間色度變化差異顯著(p<0.05)。

2.6 羊火腿風干成熟期間脂肪氧化，蛋白質氧化與色度的相關性分析

由表2可知，總氮含量與脂肪含量、羰基含量和亮度呈顯著正相關(p<0.05)，脂肪含量變化與羰基值、疏基值、丙二醛含量、過氧化值呈極顯著正相關(p<0.01)，跟顏色改變值呈顯著正相關(p<0.05)，因為脂肪含量的變化影響脂肪在風干成熟期間的氧化情況。羰基值與疏基值、過氧化值含量和黃度呈極顯著正相關(p<0.01)，蛋白質氧化導致蛋白質結構易氧化氨基酸結構的破壞影響疏水值的變化。疏基值與丙二醛含量和過氧化值的變化呈顯著正相關(p<0.01)。雖然脂肪和蛋白質氧化反應途徑不同，但2種反應都受到類似促氧化劑和抗氧化因子的影響，其次脂質氧化過程所產生的次級產物如醛類易導致蛋白質氧化[26]，從表2也得出相似的結論。丙二醛含量和過氧化值及顏色改變值呈極顯著正相關(p<0.01)，大量文獻提出肉制品的氧化會導致色度的變化，影響產品的感官特性。由表2可知，羊火腿風干成熟期間顏色改變值跟羊火腿羰基含量呈顯著正相關(p<0.05)，疏基含量呈極顯著正相關(p<0.01)。FAUSTMAN[27]研究發現，肌肉高鐵肌紅蛋白含量與脂質氧化和蛋白質氧化作用緊密相關，動物死后，高鐵肌紅蛋白還原酶被耗盡后，高鐵肌紅蛋白無法按正常代謝途徑被還原為脫氧肌紅蛋白，逐漸積累增多，造成肉品蛋白質氧化變性，高鐵肌紅蛋白含量積累越高，氧化速率越快。VENTANAS等[28]提出，脂肪氧化促進肌紅蛋白氧化，結果火腿蛋白質氧化影響火腿顏色的變化。通過研究羊火腿風干成熟期間的脂肪、蛋白質氧化以及氧化對羊火腿顏色的變化也得出相似的結論。

表2 羊火腿風干成熟期間脂質，蛋白質氧化與色度的相關性分析Table 2 Correlative analysis of lipid, protein oxidation to color changes during drying maturation process ofdry cured sheep ham

注：*.顯著相關(p<0.05)；**.極顯著相關(p<0.01)。

3 結論

羊火腿風干成熟期間蛋白質氧化，脂肪氧化始終存在，腌制階段和風干前中的蛋白質、脂肪氧化比風干后期和成熟期劇烈，風干后期和成熟期緩慢下降，此階段亮度和紅度的變化比較明顯。

通過羊火腿風干成熟期間脂肪氧化，蛋白質氧化與色度變化相關性分析得知，羊火腿風干成熟期間脂肪氧化過程所產生的中級和次級產物促進蛋白質氧化，蛋白質氧化通過高鐵肌紅蛋白的積累和氧化影響火腿色度的變化。在羊火腿加工過程，通過抑制脂肪氧化，不僅能抑制羊火腿氧化酸敗，還能防止火腿在加工期間蛋白質氧化所導致的產品品質惡化和色度的變化。