5 L發(fā)酵罐中棘白菌素B發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化

胡曉龍，秦海彬，吳旭萍，毛健，鄒樹平，牛坤

(浙江工業(yè)大學 浙江省生物有機合成研究重點實驗室，浙江 杭州，310014)

阿尼芬凈是棘白菌素類“王牌抗生素”，能夠非競爭性地抑制真菌細胞壁β-1, 3-葡聚糖合成酶的活性，從而達到抗真菌的目的[1]。目前該藥物已在美國和歐洲批準上市，而國內(nèi)尚在臨床階段，無企業(yè)生產(chǎn)此類藥物，導致其市場壟斷、價格高，因此對該藥物的高效生產(chǎn)技術進行研發(fā)，實現(xiàn)其國產(chǎn)化，將有助于打破國際制藥企業(yè)的壟斷，為患者提供價廉質(zhì)優(yōu)的抗真菌藥物，具有重要的經(jīng)濟和社會效益[2]。

該藥物主要通過對棘白菌素B(Echinocandin B, ECB)的脂肪酸側(cè)鏈進行修飾替換而得到，因此，ECB是阿尼芬凈的重要前體物質(zhì)，其發(fā)酵產(chǎn)量的高低顯著影響阿尼芬凈的生產(chǎn)成本[3-5]。目前，國內(nèi)外棘白菌素B均采用微生物發(fā)酵法進行制備，其中主要是以工業(yè)化的Aspergillusrugulosus菌株和構巢曲霉(Aspergillusnidulans)進行發(fā)酵，而目前其發(fā)酵產(chǎn)量過低仍是限制阿尼芬凈產(chǎn)業(yè)化的關鍵問題。前人對棘白菌素類抗生素的發(fā)酵過程已經(jīng)開展了大量研究，包括溫度、pH值以及培養(yǎng)基組成等。與生產(chǎn)紐莫康定B0和FR901379的發(fā)酵過程相似，合成ECB的最適溫度一般為24～28 ℃，而A.rugulosus的最適生長溫度則在37 ℃左右，在ECB最適生產(chǎn)溫度24～28 ℃則生長緩慢，且該菌發(fā)酵生產(chǎn)ECB對溫度表現(xiàn)出極高的敏感度，在37 ℃發(fā)酵液中幾乎沒有ECB的生成[6-7]。除此之外，ECB的六肽支架結構主要由6個氨基酸組成：4R, 5R-二羥基-L-鳥氨酸、L-蘇氨酸、4R-羥基-L-脯氨酸、3S, 4S-二羥基-L-高酪氨酸、L-蘇氨酸和3S-羥基-4S-甲基-L-脯氨酸[1]。因此，在許多文獻中考察了不同氨基酸前體的添加對ECB發(fā)酵產(chǎn)量的影響，例如添加15 g/L的L-酪氨酸和L-苯丙氨酸能達到比較好的結果，因為它們可以合成4-羥基-苯基-丙酮酸，是高酪氨酸合成的前體[8]。國內(nèi)有關發(fā)酵制備ECB的文獻較少，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院報道了關于制備ECB的方法，其產(chǎn)量為712 mg/L[9]；華北制藥集團在高純度制備ECB方法的專利中報道ECB產(chǎn)量為750～850 mg/L[10]；2013年上海醫(yī)藥工業(yè)研究院對ECB的生產(chǎn)方法進行了報道，產(chǎn)量為750～900 mg/L[11]，相對較低的產(chǎn)量也反映出該絲狀真菌在發(fā)酵過程中碰到的一些難以克服的技術問題，如發(fā)酵液粘度過高，供氧不足以及傳質(zhì)受阻等，本實驗室也開展了大量工作，通過菌種改造、發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化等方法可以使搖瓶發(fā)酵過程中ECB產(chǎn)量穩(wěn)定在2 000 mg/L以上[12-14]。

本文在上述搖瓶發(fā)酵的基礎上考察了5 L機械攪拌罐中的發(fā)酵情況，對其中影響曲霉生長的主要因素，如攪拌槳類型、攪拌轉(zhuǎn)速以及通氣量等進行了考察，從而優(yōu)化ECB在發(fā)酵罐中的發(fā)酵條件，為后續(xù)中試及生產(chǎn)放大提供一定的數(shù)據(jù)基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

菌株AspergillusnidulansZJB09223，為本實驗室保藏菌株。該菌株在搖瓶中的發(fā)酵產(chǎn)量維持在2 000 mg/L左右。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，甘油10，棉籽粉25，pH 6.8～7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：花生油20，甘油10，蛋白胨10，L-脯氨酸5，甘露醇100，康明威豆粕40，K2HPO4·3H2O 10，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，CaCl20.5，CuSO40.6，鳥氨酸6，番茄粉15，pH 7.0。

1.3 培養(yǎng)方法及培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)：用無菌環(huán)從甘油管中挑取少量的孢子接種到新鮮PDA斜面培養(yǎng)基中，25 ℃避光倒置培養(yǎng)12～14 d，菌體顏色由白色變?yōu)槟G色。

種子液培養(yǎng)：從斜面培養(yǎng)基上用無菌接種鏟挑取0.5 cm×1.0 cm左右的菌落接種于裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中(100 mL/500 mL)，置于調(diào)速搖床上培養(yǎng)2 d(25 ℃，220 r/min)。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將上述種子液按照10%接種量(v/v)接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，220 r/min，25 ℃培養(yǎng)12 d。發(fā)酵過程中，發(fā)酵液由白色漸漸變成紅色，最后加深變?yōu)樯詈稚?/p>

發(fā)酵罐初始培養(yǎng)條件：將培養(yǎng)48 h的種子液按10%接種量(v/v)接種于5 L發(fā)酵罐中，于25 ℃，400 r/min，通氣量1.0 VVM，初始pH 6.5的條件下，培養(yǎng)15 d。

1.4 分析方法

生物量(g/L)：取20 mL菌液離心去上清液，菌體放入烘箱90 ℃烘干至衡重，計算得到生物量。

ECB的檢測：ECB采用高效液相色譜儀(LC-2010A，島津)分析檢測，色譜柱為C18柱(大連依利特4.6 mm×250 mm×5 μm)；流動相為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=7∶1∶2；流速1 mL/min；紫外檢測波長222 nm；進樣量20 μL; 柱溫40 ℃。取ECB標品(GC>99 %)，溶于甲醇中，配制成不同濃度的標品溶液，取1mL于液相瓶中進行液相檢測。

發(fā)酵液預處理：取1 mL發(fā)酵液于2 mL EP管中，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清液；剩余菌體加入5 mL甲醇萃取靜置30 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min；取上清用0.22 μm有機膜過濾后，進行液相檢測。

2 結果與分析

2.1 Aspergillus nidulans ZJB09223在5 L機械攪拌罐中的發(fā)酵特性

本實驗的發(fā)酵液黏度較高，而機械攪拌式生物反應器具有較強的剪切力和傳質(zhì)速率，因此本研究選用5 L 機械攪拌罐，考察該發(fā)酵過程的基本特性。選擇種齡為48 h的種子液、培養(yǎng)溫度25 ℃，pH 6.5的條件下進行培養(yǎng)。在通氣量為1.0 VVM、攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min條件下發(fā)酵進程如圖1所示。

圖1 Aspergillus nidulans ZJB09223在5 L機械攪拌發(fā)酵罐中的發(fā)酵特性Fig.1 Profile of Aspergillus nidulans ZJB09223 fermentation in 5 L mechanical agitating fermentor

從圖1可知，在發(fā)酵初期菌絲體即開始大量生長，發(fā)酵液中部分菌體附著在固形碳氮源上，形成大小不一的菌絲球，部分菌絲呈絮狀生長，在發(fā)酵第4天即達到細胞干重的最大值，89.5 g/L。同時，發(fā)酵液黏度不斷增加，溶氧顯著下降到13%左右，發(fā)酵液出現(xiàn)白色絮狀菌絲；第4～8天，發(fā)酵液中的固形碳氮源被大量消耗，菌絲球減少，大量菌絲體呈絮狀生長，并附著在攪拌槳、發(fā)酵罐內(nèi)壁以及擋板上結塊生長，直到發(fā)酵結束菌體量下降至52 g/L左右。在菌體下降的過程中，發(fā)酵液顏色由白色變?yōu)殚偌t和紅棕色，ECB作為次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量逐漸增加，在發(fā)酵第14天達到峰值207 mg/L。菌絲破裂釋放胞內(nèi)酸性物質(zhì)使pH值緩慢降低，發(fā)酵液顏色進一步加深，變?yōu)樯詈稚Ｅc此同時，發(fā)酵液中溶氧開始回升至30%左右。

在發(fā)酵過程中未調(diào)控pH值的情況下，pH值基本維持在6.5左右，而當發(fā)酵進行至第11天后，pH值開始呈現(xiàn)緩慢降低，最終降到6.0，這主要是因為細胞破裂，胞內(nèi)酸性物質(zhì)的釋放造成的。以上結果表明，生物反應器相比于搖瓶中生產(chǎn)ECB積累有所延遲，其原因可能是在菌體開始大量生長的階段，發(fā)酵罐中的溶氧水平較低，菌絲體未達到最佳生長狀態(tài)，前體物質(zhì)合成量不足，而且相關酶進行羥基化效率不高，最終影響了次級代謝產(chǎn)物的生成。另外，在發(fā)酵罐中攪拌區(qū)域有限，菌絲體會附著在罐壁及發(fā)酵罐上部，達不到攪拌效果，無法攝取營養(yǎng)物質(zhì)合成次級代謝產(chǎn)物，因此，對發(fā)酵罐攪拌槳進行改造是十分必要的。

2.2 攪拌槳類型對棘白菌素B合成的影響

目前大多數(shù)機械攪拌發(fā)酵罐采用徑向流渦輪式攪拌器，但有研究表明，將軸向流的攪拌器應用于真菌發(fā)酵有很多優(yōu)勢，尤其是高密度、高黏度的微生物發(fā)酵。與徑向流攪拌器相比，軸向流攪拌器在介質(zhì)的功率消耗、混合性能或者傳質(zhì)效果等方面都更優(yōu)越。本實驗以發(fā)酵罐原裝的六直葉圓盤渦輪攪拌器為對照，以初始條件考察了框式攪拌器和雙折葉攪拌器對發(fā)酵生產(chǎn)ECB的影響，見圖2。

a-框式攪拌器；b-雙折葉攪拌器圖2 框式攪拌器和雙折葉攪拌器的規(guī)格參數(shù)Fig.2 Specification parameter of gate agitator and double folded blade agitator

實驗結果如圖3所示，在發(fā)酵0～6 d，3種攪拌器對應的反應器中菌絲濃度均快速增長，但是框式攪拌器的攪拌面積大，氣液混合效果更好，第4天生物量可以達到最大值98.5 g/L。相比而言，雙折葉攪拌器表面積較小，在菌體上升一定濃度后已經(jīng)不太適應較黏稠的發(fā)酵液攪拌，生物量增長較慢，菌體最大值僅為86.5 g/L。六直葉圓盤渦輪攪拌器的混合效果介于兩者之間，生物量為94 g/L。在發(fā)酵第6～15天，框式攪拌器形成的高剪切力損傷了菌絲體，菌絲濃度快速下降至46.5 g/L，導致產(chǎn)物ECB產(chǎn)量由99 mg/L下降為75 mg/L。而裝有圓盤渦輪攪拌器的發(fā)酵罐中的菌絲體受剪切力影響較小，菌絲損傷小，開始大量生成產(chǎn)物，最終產(chǎn)物質(zhì)量濃度為213 mg/L。雙折葉攪拌器對應的發(fā)酵罐中菌絲體受剪切力影響最小，但由于生長前中期發(fā)酵液攪拌混合不佳，溶氧水平較低影響了前體物質(zhì)的合成，導致后期ECB生成能力降低，最終產(chǎn)量僅為106 mg/L。綜上所述，由于絲狀真菌的本身特性使得攪拌槳類型對菌體生長及次級代謝產(chǎn)物的合成具有較大的影響，而本實驗由于時間有限未能得到較優(yōu)的攪拌槳類型，后續(xù)可進一步改善攪拌槳結構，例如，安裝2根獨立的攪拌器，靠近空氣分布器的位置使用高速運轉(zhuǎn)的六直葉圓盤渦輪攪拌器，有利于打碎氣泡，提高氧傳遞速率。罐身中部使用慢速的軸向流攪拌器，有利于中高黏度液體的混和，強化傳質(zhì)效果，這樣可能更有利于ECB的發(fā)酵生產(chǎn)。

a-棘白菌素B產(chǎn)量；b-菌體干重圖3 攪拌槳類型對棘白菌素B發(fā)酵過程的影響Fig.3 Effect of different agitators on ECB fermentation process

2.3 攪拌轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

對高黏度發(fā)酵過程而言，攪拌轉(zhuǎn)速也是發(fā)酵過程的重要參數(shù)，本實驗在原有發(fā)酵條件下，在300～600 r/min范圍內(nèi)初步設置4個梯度的恒定轉(zhuǎn)速，進一步對攪拌轉(zhuǎn)速控制工藝進行優(yōu)化。圖4-a顯示攪拌轉(zhuǎn)速對ECB的產(chǎn)量有較大的影響，從300 r/min開始，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的提升ECB產(chǎn)量也隨之提高，在500 r/min時，產(chǎn)量達到最大值317 mg/L，600 r/min條件下，ECB初期產(chǎn)量較大，第9天以后產(chǎn)量增速放緩，在第11天產(chǎn)物積累的量為193 mg/L，因此，最適恒定攪拌轉(zhuǎn)速控制于500 r/min，此時ECB產(chǎn)量為317 mg/L，效價比選用六直葉圓盤渦輪攪拌器后提高了47 %。

圖4-b表明在發(fā)酵0～6 d，攪拌轉(zhuǎn)速300～600 r/min范圍內(nèi)，菌絲體濃度與攪拌轉(zhuǎn)速成正比，而到發(fā)酵后期，除了300 r/min條件外，其他轉(zhuǎn)速菌絲濃度與攪拌轉(zhuǎn)速成反比。600 r/min條件下第0～6天菌絲體濃度較高，達到103 g/L，第7天后開始下降，這可能是由于在菌絲衰亡期，攪拌速度過快會造成剪切力較大，對菌絲形態(tài)造成損傷，致使產(chǎn)物代謝異常，產(chǎn)量降低。攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min時，由于發(fā)酵第0～6天菌絲體生長沒達到最佳狀態(tài)，中間產(chǎn)物積累較少，即使后期菌絲濃度有所增加，產(chǎn)物產(chǎn)量仍然很低(215 mg/L)。攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min時，發(fā)酵液混合不均勻，攪拌效果不佳，靠近發(fā)酵罐外壁的發(fā)酵液黏度高，導致ECB菌絲體濃度和產(chǎn)量均處于較低水平。

a-棘白菌素B產(chǎn)量；b-菌體干重圖4 不同攪拌轉(zhuǎn)速對棘白菌素B發(fā)酵過程的影響Fig.4 Effect of different stirring speed on ECB fermentation process

在研究恒定轉(zhuǎn)速對ECB發(fā)酵過程的影響時發(fā)現(xiàn)，第0～8天，600 r/min的條件下菌絲體濃度最大，但是發(fā)酵結束時產(chǎn)物的產(chǎn)量較低，僅為175 mg/L，說明該條件是菌絲體生長的最適攪拌轉(zhuǎn)速而不是產(chǎn)物合成時的最適攪拌轉(zhuǎn)速。由于菌絲體在發(fā)酵后期第7～15天對剪切力較為敏感，如果在最適菌絲體濃度下，適當降低攪拌轉(zhuǎn)速可能有利于ECB產(chǎn)量的提高。因此設計了如下幾組實驗進行比較：(1)攪拌轉(zhuǎn)速由600 降至500 r/min；(2)攪拌轉(zhuǎn)速由600降至400 r/min；(3)攪拌轉(zhuǎn)速由600 r/min降至300 r/min；(4)攪拌轉(zhuǎn)速恒定500 r/min。發(fā)酵第6天改變轉(zhuǎn)速，其中最適的恒定攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min作為對照組。實驗結果見圖5。

a-棘白菌素B產(chǎn)量；b-菌體干重圖5 分階段控制攪拌轉(zhuǎn)速對棘白菌素B合成的影響Fig.5 Effect of control agitator speed at different stages on ECB fermentation process

在第0～6天菌絲體生長和穩(wěn)定階段，提高攪拌轉(zhuǎn)速菌絲體濃度有一定上升，攪拌混合效果較好，中間代謝產(chǎn)物大量積累，對最終產(chǎn)物的合成有積極的影響。在第6～15天產(chǎn)物大量合成階段，將攪拌轉(zhuǎn)速適當降低至500 r/min，有利于ECB產(chǎn)量的提高，如果轉(zhuǎn)速降低至300 r/min，會導致發(fā)酵液中溶氧水平下降，ECB產(chǎn)量僅為288 mg/L。實驗結果表明，在第0～6天攪拌轉(zhuǎn)速控制600 r/min，第6～15天攪拌轉(zhuǎn)速降至400 r/min，有利于產(chǎn)物生成，ECB產(chǎn)量可以達到462 mg/L，比對照組提高了44%。采用分階段控制攪拌轉(zhuǎn)速，一方面可以提高ECB的產(chǎn)量，另一方面也關系到工業(yè)化生產(chǎn)的能耗，因此后續(xù)可以進一步優(yōu)化改變轉(zhuǎn)速的時間點，以確定既能提高產(chǎn)物產(chǎn)量又能節(jié)省能耗的調(diào)控策略。

2.4 通氣量的優(yōu)化

影響產(chǎn)量的因素除了剪切力，溶氧也是重要因素。氧氣是氧化磷酸化過程中最終的電子受體，發(fā)酵前期溶氧不足時，NADH氧化成NAD+的過程受阻，導致NADH的積累，減少了ATP的合成，而且包括菌體生長在內(nèi)的生理生化反應都受到影響。到發(fā)酵中后期，由甘露醇提供的NADPH為加氧酶提供修飾六肽環(huán)的能量，次級代謝產(chǎn)物大量合成，此時溶氧不足會直接影響產(chǎn)物的產(chǎn)量[15]。因此，本實驗在控制攪拌轉(zhuǎn)速的前提下，進一步研究溶氧對ECB合成的影響。實驗分別考察了1.0～2.0 VVM通氣量對ECB合成的影響，結果如圖6所示。

a-棘白菌素B產(chǎn)量；b-菌體干重圖6 不同通氣量對棘白菌素B合成的影響Fig.6 Effect of different ventilation on ECB fermentation process

實驗結果表明，不同的通氣量對菌體生長和ECB合成的影響趨勢基本相同，通氣量的增加可以明顯提高菌體的生物量，在1.0～1.7 VVM范圍內(nèi)，隨著通氣量的增加菌絲體最高生物量由98.5 g/L上升到106.5 g/L，有較大提高，再進一步增加到2 VVM時，菌體量基本保持不變。就ECB發(fā)酵產(chǎn)量而言，隨著通氣量的提高，其產(chǎn)量也有所增加，在1.7 VVM時達到608 mg/L，比1.0 VVM條件下提高32%。而在通氣量為2 VVM時，過大的通氣量容易使發(fā)酵液噴射到發(fā)酵罐罐頂內(nèi)壁上，菌體在上部大量生長容易堵住補水孔及出氣孔，增加罐壓及染菌風險，而且增加了能耗，因此，綜合考慮以上情況，在5 L發(fā)酵罐中使用1.7 VVM恒定通氣量。

綜上所述，ECB在發(fā)酵罐中產(chǎn)量遠低于搖瓶中產(chǎn)量(2 000 mg/L)，主要原因是兩者發(fā)酵液傳質(zhì)方式和溶氧水平有差異。ECB在搖瓶中發(fā)酵時，發(fā)酵液振蕩混合均勻、溶氧充分；而在發(fā)酵罐中由于生長對數(shù)期發(fā)酵液粘稠，雖然靠近攪拌槳處發(fā)酵液攪拌充分，而遠離攪拌槳處發(fā)酵液流動緩慢傳質(zhì)效果不佳，發(fā)酵液混合不均勻?qū)е卵鯕庠诎l(fā)酵液中分布不均，不僅致使ECB產(chǎn)量減少而且延長了ECB發(fā)酵周期。另外，攪拌槳的高速運轉(zhuǎn)在一定程度上損傷了菌絲體，使得細胞干重比搖瓶中要低，從而導致ECB產(chǎn)量的降低。

3 結論

實驗對AspergillusnidulansZJB09223在5 L機械攪拌發(fā)酵罐中的培養(yǎng)條件進行了初步探索，為ECB發(fā)酵過程的放大探明基本條件及影響因素。通過攪拌槳類型的對比，發(fā)現(xiàn)在本實驗條件下六直葉圓盤渦輪攪拌器更適合發(fā)酵生產(chǎn)ECB，而后續(xù)應該繼續(xù)在攪拌槳類型方面進行研究，從而獲得最優(yōu)的攪拌條件。從ECB發(fā)酵產(chǎn)量和生產(chǎn)能耗角度以及菌體發(fā)酵過程中的代謝規(guī)律考慮，建立了兩階段攪拌轉(zhuǎn)速控制方式，在1.7 VVM通氣條件下，發(fā)酵第0～6天，攪拌轉(zhuǎn)速控制600 r/min，發(fā)酵后期第6～15天，攪拌轉(zhuǎn)速降為400 r/min，可使ECB發(fā)酵產(chǎn)量提高至608 mg/L。雖然該產(chǎn)量比未優(yōu)化前提高了193 %，但相比搖瓶發(fā)酵水平仍有較大差距，因此，在后續(xù)ECB發(fā)酵放大過程中，需要綜合考慮攪拌傳質(zhì)及溶氧對ECB發(fā)酵過程的影響，以進一步提高發(fā)酵罐中的發(fā)酵水平。