一株產細菌素乳酸菌的篩選及其細菌素特性研究

孫杰，姜杰，馮彬斌，孔令民，汪釗，魏春

(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州， 310014)

細菌素是由某些細菌在發酵過程中通過核糖體合成產生的一類有抑(殺)菌活性的蛋白或多肽類物質[1]。細菌素的抑菌活性主要針對革蘭氏陽性菌和一些親緣關系相近的菌種，而對革蘭氏陰性菌、真菌等抗菌活性很弱或者無效。細菌素由于具有天然、無公害、無殘留、熱穩定性好、不易產生耐藥性等優點，逐漸成為微生物防腐劑研究領域中的熱點，并且被認為是“抗生素的理想替代品”。

乳酸菌是公認的具有潛在開發價值的天然生物防腐劑[2]，大多數乳酸菌會在生長過程中向外部環境中釋放具有抑菌活性的細菌素。因此乳酸菌廣泛應用于醫藥、食品以及飼料的防腐。乳酸菌細菌素的理化性質與其結構密切相關。乳酸菌細菌素一般為陽離子小肽并且具有較強的疏水性和較高的等電點。目前認為細菌素主要的作用機制為作用于細胞膜從而達到抑菌目的[3]。除了作用于細胞膜之外，細菌素還可以作用于細胞壁、抑制核苷酸合成、抑制蛋白質折疊或作用于線粒體[4-9]。

乳酸鏈球菌素(Nisin)已經作為一種公認安全、無毒的天然食品防腐劑，被廣泛應用于牛奶、罐頭、肉制品等。本研究從傳統發酵食品中篩選產細菌素穩定性和抑菌效果較強的乳酸菌菌株。對細菌素進行分離純化，以及生物學性質的探究，為其作為添加劑，以抑制食品或飼料中的腐敗菌或致病菌提供支持。

1 材料和方法

1.1 材料

浙江地區米酒、內蒙古地區酸粥。大腸桿菌(ATCC 25922)、枯草芽孢桿菌(CCTCC AB130001)、地衣芽孢桿菌(CCTCC AB205131)、發酵乳桿菌( CCTCC AB2013124)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、釀酒酵母(ATCC 9080)、白色假絲酵母(ATCC 10231)和米曲霉(CCTCC AF91012)均為實驗室保存菌株。

1.2 主要試劑盒與培養基

MRS培養基，購于OXOID 公司。MRS固體培養基加入2%的瓊脂。

改進的MRS培養基(g/L)：葡萄糖40、酵母粉30、乙酸鈉10、檸檬酸氫二銨5、磷酸氫二鉀2、硫酸錳0.25。

LB培養基(g/L)：酵母粉5、蛋白胨10、NaCl 5L，pH 7.0～7.5，121℃ 20 min 高壓蒸汽滅菌，備用。固體培養基則加入2%的瓊脂粉。

YPD培養基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母粉10，pH自然，115℃ 30 min高壓蒸汽滅菌，備用。固體培養基則加入2%的瓊脂粉。

基因組提取試劑盒和Taq酶為寶生物公司產品。其余試劑為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 樣品中乳酸菌的分離與初篩

將酸粥和米酒上清液用0.9%的生理鹽水梯度稀釋，吸取100 μL涂布到MRS固體培養基上，30 ℃培養48 h。用無菌接種環挑取具有不同菌落形態的單菌落接種于MRS液體培養基，30 ℃培養24 h。菌液8 000 r/min離心10 min取上清液，0.22 μm的微孔濾膜過濾后進行抑菌活性分析。

1.3.2 瓊脂擴散法測定抑菌活性。

大腸桿菌(ATCC 25922)作為指示菌株，接種于LB培養基，37 ℃、200 r/min培養過夜。用0.9%的生理鹽水稀釋大腸桿菌菌液至OD600值為1，取稀釋后的菌液1 mL加入到冷卻至50～60 ℃的100 mL固體LB培養基中混勻，倒平板。平板冷卻后用直徑10 mm打孔器均勻打孔。吸取待測樣品100 μL加入到孔洞中，37 ℃培養15 h，測量抑菌圈直徑并記錄(抑菌圈直徑=測量直徑-打孔器直徑)。挑選抑菌活性較強的菌株進行下一步實驗。

1.3.3 抑菌物質的初步鑒定

1.3.3.1 有機酸排除試驗

由于細菌素一般在酸性條件下抑菌活性強，在中性及堿性條件下抑菌活性較弱或失活，故本實驗不調發酵液的pH值，而是配制與發酵液上清液具有相同pH值的乳酸和乙酸溶液，并檢測有機酸溶液的抑菌活性。

1.3.3.2 過氧化氫排除試驗

記錄抑菌效果較好并預處理好的發酵液上清液的pH值，然后將發酵液調pH值為7.0，加入過氧化氫酶使其終濃度為4.5 g/L，37 ℃溫浴1 h后將pH值調至與原發酵液相同，檢測其抑菌活性。

1.3.4 具有較強抗菌性能細菌素的穩定性對比

為觀察溫度穩定性，將發酵上清液，分別在60、80、100、121 ℃恒溫處理30 min，并以未經熱處理的發酵液上清為對照進行抑菌活性分析。為研究pH值穩定性，用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl將發酵上清液pH值調為2、4、6、8、10，在30 ℃靜置后90 min調回初始pH值，以未調pH值的上清液為對照進行抑菌活性分析。為研究酶解穩定性，將處理好的發酵液上清液pH值調至木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、糜蛋白酶的最適pH值，在各酶的最適溫度下處理90 min(各種蛋白酶的終濃度為1 mg/mL)。將處理好的酶解液調至發酵液的初始pH值，測定其抑菌活性。

1.3.5 菌株鑒定

1.3.5.1 生理生化鑒定實驗

參照凌代文和東秀珠的方法[10]，采用形態觀察和過氧化氫酶實驗、糖發酵實驗、吲哚實驗、硝酸鹽還原實驗等常規生理生化檢測方法對實驗菌株進行下一步鑒定。

1.3.5.2 菌株16S rDNA鑒定

用Takara細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組，PCR擴增16S rDNA片段，擴增引物為：

上游引物：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；下游引物：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’

PCR反應程序為98 ℃變性2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1.5 min，32個循環。

PCR產物由北京擎科新業生物技術有限公司進行測序。

根據16S rDNA序列結果通過Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源性對比，利用MEGA 6.0軟件中的Phylogeny中的Construct/Test Neighbor-joining Tree方法構建進化樹，并經Bootstrap重復驗證1 000次。

1.3.6 乳酸菌細菌素的純化

使用陽離子交換柱CM SefinoseTMFF純化乳酸菌細菌素。用含1 mol/L NaCl的5 mmol/L乙酸鈉緩沖液梯度洗脫，流速為1 mL/min，在280 nm和220 nm紫外檢測，收集蛋白峰，檢測蛋白含量和抗菌活性。之后使用制備液相色譜，進一步純化細菌素。用5 mmol/L乙酸鈉緩沖液平衡。流速為3 mL/min，紫外檢測波長為280 nm。收集蛋白峰。計算純化過程中的純化倍數和細菌素收率等。將純化后的細菌素凍干濃縮，加去離子水溶解進行Tricine-SDS-PAGE電泳[11]。將得到的目的蛋白條帶切下，放于混有E.coli的LB平板上進行抑菌活性檢測。

1.3.7 WZS02發酵液的細菌素效價測定

目前細菌素效價測定方法多采用逐步稀釋法[13]或者與Nisin進行對比，本實驗以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，將Nisin標準品用pH值4.5的乙酸鈉緩沖液稀釋成1 mg/mL，然后將發酵液梯度二倍稀釋與1 mg/mL的Nisin標準品一起采用打孔法測定抑菌活性，打孔器直徑為5 mm，加入的量為50 μL。抑菌活性的計算方式：如果稀釋2n倍具有最小抑菌圈，那么細菌素的效價為2n×1 000 μL/50 μL，將細菌素的效價轉換為Nisin的標準效價。

2 結果與討論

2.1 樣品中乳酸菌的分離與初篩

從米酒和酸粥中分離篩選了60株乳酸菌，選擇其中抑菌效果較好的3株菌作為研究對象，分別命名為菌株WZK01、WZK02和WZS02。乳酸菌發酵液中含有乳酸、乙酸和過氧化氫。為了證明這些菌株的抑菌活性并不是來源于有機酸和過氧化氫，進行了有機酸和過氧化氫的排除實驗。發現與發酵液具有相同pH值的乳酸和乙酸并不會產生抑菌圈。說明乳酸菌的抑菌活性并不依靠發酵液中的有機酸，其抑菌活性來源于發酵液中的其他物質。過氧化氫酶處理發酵液后，發酵液的抑菌圈直徑僅有微弱的減少，說明乳酸菌在生長代謝中產生的過氧化氫具有一定的抑菌活性，但并不起到決定性作用。因此初步認為乳酸菌發酵液的抑菌活性主要來源于其中的細菌素。

2.2 三株乳酸菌發酵液抗菌活性穩定性的對比

如圖1-a所示，菌株WZS02細菌素熱穩定性最好，其可以耐受121 ℃的高溫，并且后續經過抑菌率試驗測得121 ℃處理30 min后活性僅降低了8%左右。pH值穩定性結果表明這3種乳酸菌細菌素的pH值適應范圍都較窄并且在強酸性處理條件下活性降低，隨著pH值增高至堿性，抑菌活性降低甚至失活。這3種乳酸菌細菌素中的WZK01細菌素和WZK02細菌素的最適pH值均為6，而WZS02細菌素的最適pH則為4(圖1-b)。

a-溫度穩定性;b-pH穩定性對比; c-酶解穩定性對比圖1 三株乳酸菌發酵液抗菌活性穩定性的對比Fig.1 Comparison of the stability of the antibacterial activity of three strains of lactic acid bacteria

圖1-c表明本實驗所采用的各種蛋白酶對于這3株乳酸菌發酵液中的抑菌物質均具有一定的水解作用，同時根據蛋白酶酶解后抑菌活性下降劇烈這一現象可以判斷這3株乳酸菌發酵液中的抑菌物質為細菌素。從圖中可以看出糜蛋白酶對于這3株乳酸菌分泌的細菌素酶解能力較強，胃蛋白酶以及胰蛋白酶處理后活性損失較小。這3株乳酸菌細菌素經過蛋白酶處理90 min后活性大部分喪失。因此其如果作為飼料添加劑，不會對環境產生過多的污染。綜合以上研究結果發現，WZS02細菌素具有熱穩定性好、抗菌性能強、對環境友好等優點，因此選用WZS02為后續研究菌株。

2.3 菌株鑒定

將抑菌活性強的WZS02、WZK01、WZK02菌株進行16S rDNA擴增，并將擴增產物測序。根據GenBank中16S rDNA序列同源性比較發現WZS02菌株與植物乳桿菌的同源性為99%；WZK01菌株與發酵乳桿菌的同源性為99%；WZK02與明串球菌的同源性為99%。在GenBank中選擇合適菌株的16S rDNA序列構建進化樹(圖2)。

圖2 三株乳酸菌的系統進化關系Fig.2 Phylogenetic relationships of three lactic acid bacteria

結果表明WZS02菌株與L.plantarumBCH-2的同源性為100%，因此將其命名為L.plantarumWZS02；WZK01菌株與L.fermentumF4S8的同源性為100%，因此將其命名為L.fermentumWZK01；WZK02菌株與L.citreumKM20的同源性為97%，因此將其命名為L.citreumWZK02。

由于WZS02細菌素的溫度穩定性明顯優于其他2種，因此本文以其為研究對象進行下一步實驗。參照《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》，進一步對WZS02菌株進行了生理生化實驗確認。該菌株過氧化氫試驗、硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗、明膠液化試驗呈陰性，不產硫化氫，pH 4.5能生長，能夠發酵果糖、葡萄糖、蔗糖等碳水化合物，不能發酵阿拉伯糖和木糖。顯微鏡觀察實驗表明，WZS02菌體成桿狀，單個、成對或成鏈狀排列，革蘭氏染色陽性，無芽孢。根據生理生化鑒定與菌體形態進一步確定菌株WZS02為植物乳桿菌(L.plantarum)，與之前的16S rDNA鑒定結果一致。

2.4 生長曲線的測定及其與抑菌活性的關系

將活化好的菌株以2%的接種量接種到改進的MRS培養基中，放置在37 ℃培養箱中培養。如圖3所示，菌株從18 h左右進入穩定期，OD在2.25左右維持穩定，并在28 h左右進入衰亡期，菌體開始自溶導致OD值下降。細菌素WZS02在發酵6 h后產生，說明細菌素為次級代謝產物，發酵時間8 h后，從抑菌曲線來看隨著菌體量增長，細菌素的產量也在不斷增加，當發酵時間達到20～26 h時，即菌株穩定期的后期、衰亡期的前期，發酵液中細菌素的含量也達到最大，抑菌率為52%左右，隨后抑菌活性有所下降，或許與菌體自溶導致胞內蛋白酶流出降解細菌素有關。

圖3 植物乳桿菌WZS02的生長量與抑菌活性的關系Fig.3 The relationship between the growth of LZ lactic acid bacteria WZS02 and the antibacterial activity

2.5 植物乳桿菌WZS02細菌素的純化

采用CM SefinoseTMFF陽離子交換柱對發酵液中的細菌素進行純化，將有抑菌活性的洗脫液泵入制備液相色譜，在280 nm下測得蛋白吸收峰。每一步純化倍數與回收率見表1。

表1 細菌素WZS02純化表Table 1 Purification table of bacteriocin WZS02

注：以發酵液抑菌活性為1，離子交換以及液相制備的抑菌活性與發酵液對比后計算相對總活力與相對比活力。

將經陽離子交換層析以及液相制備色譜純化得到的蛋白樣品進行Tricine-SDS-PAGE(圖4-a)，在1.7～4.6 kDa之間可見明顯的小肽條帶。將該小肽條帶切下，并取空白蛋白膠為對照測其抑菌活性。從圖4-b中可以看出Tricine-SDS-PAGE得到的細菌素蛋白條帶仍保持有一定的抑菌活性，這一現象表明即使經過SDS變性劑處理以及熱處理后，細菌素WZS02仍能保持一定的生物活性。

a-Tricine SDS-PAGE電泳圖；b-蛋白條帶抑菌活性檢測圖4 Tricine SDS-PAGE電泳圖與蛋白條帶抑菌活性檢測Fig.4 Tricine SDS-PAGE and detection of antibacterial activity of protein bands

2.6 WZS02細菌素的效價及抑菌譜測定

測定改進的MRS培養基中培養WZS02菌株24 h的發酵液中的細菌素效價。以大腸桿菌為指示菌，有明顯抑菌圈的最大稀釋倍數為8倍，計算得效價為160 AU/mL，根據原發酵液與1 mg/mL的Nisin標準品(1 000 IU/mg)的抑菌率的比值，算得以大腸桿菌為指示菌其相對Nisin的效價為9 097 IU/mL。以金黃色葡萄球菌最為指示菌，有明顯抑菌圈的細菌素最大稀釋倍數為16倍，計算得效價為320 AU/mL，根據原發酵液與1 mg/mL的Nisin標準品(1 000 IU/mg)的抑菌率的比值，算得其對金黃色葡萄球菌的抗性為2 796 IU/mL。因此，WZS02的細菌素對革蘭氏陰性及陽性均具有較強的抗性，同時也證明了其抑菌譜較廣，抑菌活性強于Nisin。同時也證明了細菌素對革蘭氏陽性的抗性一般強于革蘭氏陰性。

表2 細菌素WSZ02的抑菌譜Table 2 Bacteriostatic spectrum of WZS02 bacteriocin

注:“+++”直徑 ≥ 20 mm高度敏感；“++”直徑 ≥ 10 mm中度敏感；“+”直徑 ≥ 0 mm低度敏感；“—”無抑菌作用。

測定了細菌素WZS02對實驗室現有的一些菌株的抑制效果。從表2中可以看出細菌素WZS02具有較廣的抑菌譜，其對革蘭氏陽性菌及陰性菌均具有較強的抑制效果，并且對革蘭氏陽性菌或陰性菌中的腐敗菌(枯草芽孢桿菌)及致病菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)抑菌活性較強。此外，對部分真菌(如假絲酵母)也具有一定的抑菌活性。

3 結論

本研究通過發酵液的抑菌活性、酶解穩定性、溫度穩定性及pH值穩定性等測定，從傳統發酵食品中，篩選出一株對革蘭氏陽性和陰性均具有較好的抑制效果的菌株，經分子和生理生化鑒定后，命名為L.plantarumWZS02。將發酵液上清液通過陽離子交換樹脂層析和液相制備純化，得到細菌素純度較高的蛋白溶液。然后對抑菌譜進行了測定，發現其對大部分革蘭氏陽性菌以及陰性菌均有較好的抑制效果，為其作為食品或飼料中的添加劑，以抑制食品或飼料中的腐敗菌或致病菌提供了有力支持。