貝伐單抗聯合多西環素治療膠質瘤的療效與機制研究*

黃培成 程小耕 楊強 畢敬濤 曹姍姍

(1.綿陽市中心醫院藥學部，四川 綿陽 621000；2.北京積水潭醫院，北京 100035；3.北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026)

膠質瘤是最常見的中樞神經系統原發性惡性腫瘤，其腫瘤進展快且復發率高，目前國際上對膠質瘤的治療技術手段和方案的研究不斷取得進展，但膠質瘤患者的生存期仍不容樂觀[1-3]。近年來，腫瘤的分子靶向治療逐漸成為研究熱點，而血管內皮生長因子被認為是腦膠質瘤治療的重要靶點[4-5]。

目前以促血管生成信號通路為靶點的治療方案已應用于多種腫瘤的治療，針對VEGF (Vascular endothslia growth factor)信號通路開發的多種抗血管生成抑制劑已見于臨床治療或臨床試驗研究中[6-7]。貝伐單抗是重組的人源化單克隆抗體，能抑制VEGF活性，使其腫瘤組織停止生長從而發揮抗瘤作用，是首個被FDA批準可用于臨床治療的抗腫瘤血管生成藥物[7-9]。但單藥治療復發性膠質瘤，其疾病生存率仍沒有較大改善，利用膠質瘤原代細胞，聯合用藥進行處理，對細胞的增殖，遷移及侵襲能力差異的檢測，探討貝伐單抗聯合多西環素對膠質瘤治療的作用及初步機制，為臨床治療提供有力的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 膠質瘤病人術后組織分離培養而得的原代細胞。

1.1.2 裸鼠 購自四川大學實驗動物中心。

1.1.3 試劑 DMEM、FBS均購自于GIBCO公司；胰蛋白酶購自碧云天公司；貝伐單抗購自于羅氏公司；多西環素購自大連Melonepharma公司；MTS購自貝博；結晶紫、中性樹膠購自索萊寶； CD34抗體和Ki67抗體均購自北京中衫金橋；山羊血清封閉液和山羊抗鼠二抗均購自福州邁新生物技術開發有限公司；蘇木素及福爾馬林組織固定液購自索萊寶生物技術有限公司。

1.1.4 儀器 細胞培養箱購自美國Thermo公司；倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司；生物安全柜購自蘇凈公司；高壓鍋及微波爐購自中國Galanz公司；miniQ去離子水儀購自美國Millipore公司。

1.1.5 貝伐單抗的配制 向100 mg/4 ml的貝伐單抗溶液中加入46 ml PBS稀釋，其終濃度為2 mg/ml，分裝于1.5 ml離心管中，4℃保存。其體外細胞的實際治療濃度為2 μg/ml，體內裸鼠的實際治療濃度為15 mg/kg。

1.1.6 多西環素的配制 稱取25 g貝伐單抗粉末，用250 ml無菌水溶解，分裝，-20 ℃避光保存。使用前，常溫避光溶解；按照1:50稀釋至小鼠清潔飲用水中(含1%的蔗糖水溶液)，水瓶用錫箔紙包住避光，每3天換液一次。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 膠質瘤原代細胞分離培養方法：取術后新鮮的膠質瘤組織，用眼科剪剪去壞死區域，PBS洗3次，之后用眼科剪剪碎組織，置于15 mL離心管中，加1 mg/mL的I、IV型膠原酶各3 mL，離心管置于37℃搖床中，220 rpm/min搖2 h，之后將組織裂解液依次過100 μm、40 μm的細胞篩網，將過濾后的細胞懸液1000 rpm，離心5 min，棄凈上清，將細胞用含10% FBS的高糖DMEM培養基置于5% CO2、37℃的細胞培養箱中培養，待細胞長至第三代后，取對數生長期的細胞用于后續的體內體外實驗。

1.2.2 細胞MTS檢測 細胞至對數生長期時，用胰蛋白酶消化細胞并計數。使其每孔的細胞數量為2000個，每孔100 μl。每組5個復孔，共3組，分別為生理鹽水組、貝伐單抗組、貝伐單抗聯合多西環素組，各組每2天換1次液，貝伐單抗與貝伐單抗每孔加藥濃度均按2 μg/mL計算；共5行，每1行為1個檢測時間點，在每個對應的時間點加入10 μl MTS，培養2 h，測OD 490。

1.2.3 平板克隆形成 根據計數的濃度鋪6 cm皿，使其細胞數量為500 個/皿，貝伐單抗與多西環素每孔加藥濃度均按2 μg/mL計算，各組每2天換一次液，共培養14 天。棄去培養基，PBS洗3次，用75%乙醇固定15 min，PBS洗3次，加入結晶紫染30 min，流水清洗干凈后，室溫晾干，拍照觀察。

1.2.4 劃痕實驗 根據計數的濃度鋪6cm皿，使其細胞數量為4×106個/皿，按分組加藥，貝伐單抗與多西環素每皿加藥濃度均按2 μg/mL計算，待細胞過夜培養長滿后做劃痕，分別在0、24、48小時拍照觀察。

1.2.5 Transwell侵襲實驗 根據計數的濃度將細胞鋪在帶膠的小室中，加藥濃度均按2 μg/mL計算，加在小室上層內，上層內用無血清DMEM，下層中加入含10% FBS的DMEM，4%多聚甲醛固定后，結晶紫染色5 min，自來水清洗終止反應，顯微鏡下觀察小室下層侵襲細胞并計數。

1.2.6 裸鼠成瘤實驗 購買4～6周齡雄性裸鼠，于小鼠皮下注射200×104個/200 μl原代細胞。于接種15天后開始治療，一組以生理鹽水作為對照，一組在腹腔注射貝伐單抗，貝伐單抗按裸鼠體重15 mg/kg進行注射，每2天注射1次貝伐單抗；第三組腹腔注射貝伐單抗的同時在飲水中加入多西環素，多西環素按終濃度20 mg/mL稀釋于飲水中，每3天換1次水，貝伐單抗濃度同前；各組均治療42天。與此同時，于接種膠質瘤原代細胞后第7天開始測量移植瘤大小，每隔1周記錄1次。

1.2.7 移植瘤免疫組化染色 待裸鼠腫瘤長至42天，取出腫瘤石蠟包埋后。烤片脫蠟，經過一系列修復，10%山羊血清封閉，分別加CD34及Ki67抗體，4℃孵育過夜后加山羊抗鼠二抗，最后用DAB顯色，用蘇木素復染細胞核，經脫水和透明后，封片并拍照觀察。

1.3 統計學分析 采用SPSS軟件進行計數資料χ2檢驗，組間差異采用t檢驗，P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 3組抑制細胞增殖比較 MTS結果顯示，與生理鹽水組相比較，貝伐單抗組的增殖能力明顯減弱(P<0.05)，而貝伐單抗聯合多西環素組的抑制增殖能力更為明顯，較貝伐單抗組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 MTS檢測細胞增殖Figure 1 MTS detects cell proliferation注：與生理鹽水組比較，①P<0.05，②P<0.01

2.2 3組抑制細胞平板克隆形成比較 克隆形成實驗結果顯示加貝伐單抗單藥處理之后，與生理鹽水組比較細胞的克隆形成能力減弱，差異有統計學意義(P<0.05)，貝伐單抗聯合多西環素處理之后，細胞的克隆形成能力減弱更顯著，較貝伐單抗組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，這與MTS的結果具有一致性，見圖2 A、B。

2.3 3組抑制CD34、Ki67表達比較 取出的裸鼠移植瘤，進行免疫組織化學染色，觀察CD34和Ki67的

表達情況，與生理鹽水組相比較，貝伐單抗單藥治療后，移植瘤的CD34表達明顯下降，且增殖指標Ki67表達也降低，說明血管密度降低；經貝伐單抗聯合多西環素治療后，CD34和Ki67表達信號幾乎很難發現，這表明血管密度和增殖指標降低更明顯，見圖3。

圖2 平板克隆形成定性染色和定量分析

Figure2PlateCloneFormationQualitativeDyeingandQuantitativeAnalysis

注：A.定性染色;B.定量分析;與生理鹽水組比較，①P<0.05，②P<0.01

2.4 3組抑制細胞侵襲能力比較 Transwell侵襲結果表明，經貝伐單抗處理后的細胞比生理鹽水組的細胞侵襲能力減弱將近40%(P<0.05)，而貝伐單抗聯合多西環素進行處理，細胞侵襲能力比單加貝伐單抗減弱趨勢更明顯，其抑制能力高達80%，較貝伐單抗組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖4 A、B。

圖3 免疫組化染色Figure 3 Immunohistochemical staining注：移植瘤做免疫組織化學染色，黃色為標志物信號

2.5 3組抑制裸鼠皮下成瘤比較 結果顯示，經貝伐單抗治療后裸鼠的移植瘤相對于生理鹽水組有所減小(P<0.05)，而經貝伐單抗跟多西環素聯合用藥后，移植瘤更小，治療效果更佳(P<0.01)，見圖5 。

2.6 3組抑制細胞遷移能力比較 細胞遷移實驗結果顯示，與生理鹽水組比較，加貝伐單抗單藥之后膠質瘤細胞的遷移能力減弱(P<0.05)，貝伐單抗聯合多西環素處理的細胞遷移能力減弱更明顯，較貝伐單抗組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖6A、B。

3 討論

惡性腦膠質瘤目前的標準治療方案是最大程度的手術切除，但手術后殘存的腫瘤細胞導致腫瘤復發，其預后效果差[10]。近年來，抑制腫瘤新生血管內皮細胞生成從而阻斷供血，進而導致腫瘤細胞壞死，已成為腫瘤治療的一個重要策略[11]。

圖4細胞侵襲定性染色和相對定量分析
Figure4Cellinvasionqualitativestainingandrelativequantification

注：A.細胞侵襲定性染色;B.相對定量分析;與生理鹽水組比較，①P<0.05，②P<0.01；與貝伐單抗組比較，③P<0.05

圖5 移植瘤大小、重量、生長曲線Figure 5 Transplanted tumor size , xenograft weight and xenograft tumor growth curve

注：A.移植瘤大小；B.移植瘤重量;C.移植瘤生長曲線；與生理鹽水組比較，①P<0.05，②P<0.01；與生理鹽水組比較，③P<0.05，④P<0.01

圖6 細胞遷移和創傷愈合率Figure 6 Cell migration and wound healing rate

注：A.細胞遷移創傷;B.創傷愈合率;遷移24h時，與生理鹽水組比較，①P<0.05，②P<0.01；創傷遷移48h時，與生理鹽水組比較，③P<0.05，④P<0.01

貝伐單抗能特異性的結合VEGF，抑制腫瘤新生血管形成，進而控制腫瘤生長[12-13]。本研究提示貝伐單抗能抑制人膠質瘤原代細胞增殖、遷移和侵襲能力，并發現其可影響CD34和Ki67的表達來抑制裸鼠皮下成瘤能力。2012年貝伐單抗被NCCN指南推薦單藥或與其它細胞毒性藥物聯合用于治療復發惡性腦膠質瘤，但是目前還沒有公認的最佳藥物聯合方案[14-16]。因此對于貝伐單抗能否提高患者的遠期生存還存有爭議。血管生成的相關因子除了VEGF外，還與基質金屬蛋白酶(MMPs)密切相關[17]。多西環素是四環類抗菌藥物，同時也是非特異性MMPs抑制劑[18-19]。

本研究利用膠質瘤原代細胞為實驗對象，對細胞進行生理鹽水、貝伐單抗和貝伐單抗聯合多西環素處理，其結果顯示貝伐單抗聯合多西環素藥物處理的細胞明顯比單獨貝伐單抗加藥處理的抑制能力強，不僅抑制細胞增殖，還抑制細胞的遷移能力和侵襲能力，使其藥物作用具有一種疊加效果。貝伐單抗短期治療可抑制腫瘤生長，但隨著時間延長，其作用減弱，若聯合多西環素，可改善腫瘤細胞環境，調節MMP2的翻譯后活性，兩者聯合使用大大增強了對腫瘤生長的抑制能力。為觀察藥物在體內的抑制作用，本實驗構建膠質瘤皮下裸鼠成瘤模型，貝伐單抗可抑制裸鼠成瘤的生長，其抑制率約為30%，此研究結果與之前相關報道具有一致性[20]，另外，本研究發現貝伐單抗聯合多西環素處理后其裸鼠皮下腫瘤抑制率高達65.5%，可見靶向血管內皮因子結合靶向基質金屬蛋白酶的雙向藥物，大大提高其影響功能。通過進一步分析，發現貝伐單抗聯合多西環素使CD34和Ki67的表達顯著下降，因此認為經過聯合治療后的移植瘤血管密度降低且增殖能力減弱可能是其抑制裸鼠皮下成瘤能力的主要原因。

4 結論

本研究結果顯示，貝伐單抗聯合多西環素通過抑制細胞增殖、遷移和侵襲能力，藥物產生疊加效應顯著的增強抗腫瘤作用，可減少腫瘤新生血管的形成，從而抑制膠質瘤的生長、重量和體積，為臨床治療膠質瘤提供理論支持。