Treg與Th17細胞在橋本氏甲狀腺炎發病機制中的作用*

陳玉敏 胡楓湫 黃慧 陳香 王椿

(四川大學華西醫院內分泌代謝科，四川 成都 610041)

橋本氏甲狀腺炎(hashimoto's thyroiditis,HT)是機體內存在甲狀腺自身抗體以及甲狀腺組織中淋巴細胞浸潤、引起甲狀腺濾泡破壞或損傷、導致甲狀腺功能異常的自身免疫性疾病，臨床上可表現為甲狀腺毒癥或甲狀腺功能減退。有研究[1-3]指出， Treg和Th17細胞在HT的發病中有著重要的作用，他們發現在HT動物模型及患者的外周血中，Th17細胞比例明顯升高，其特異性轉錄因子RORγt表達量也明顯升高，而Treg細胞特異性轉錄因子Foxp3表達量明顯減少。既往的研究并未關注甲狀腺功能異常是否對Treg和Th17細胞的影響。因此，為排除甲狀腺功能異常對T細胞功能的影響及其HT患者甲狀腺功能正常狀態下T細胞功能的變化，本研究收集甲狀腺功能正常HT患者的外周血，觀察其Treg、Th17細胞的變化，旨在進一步探索HT的發病機制，為臨床治療HT的新方法提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2015年3月～2016年11月在四川大學華西醫院內分泌科門診就診的HT患者45例(HT組)，男性7例，女性38例，年齡21～51歲，平均(35.5±9.1)歲，其中包括因出現甲狀腺功能減退而服用L-T4將甲狀腺功能維持在正常范圍的22例(治療組)， 23例為初診的甲狀腺功能正常的HT患者(初發組)。同時納入同期至我院進行健康體檢的27名健康者設為正常對照組，其中男4名，女23名， 年齡23～49歲，平均(35.7±9.6)歲。兩組間性別構成比、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①符合HT的診斷標準：超聲檢查提示甲狀腺不均勻改變，回聲不均，可伴多發性低回聲區域或甲狀腺結節，并且TPOAb(thyroid peroxidase antibody)陽性。②甲狀腺功能正常維持3個月以上。排除標準：①合并其他自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎等。②近期使用過糖皮質激素、環孢菌素等免疫抑制劑。 ③TRAb(tsh receptor antibody)陽性。④嚴重心、肝、腎等疾病者。正常對照組入選標準：①甲狀腺功能正常，TgAb(antithyroglobulin antibody)、TPOAb、TRAb在正常范圍內。②既往無甲狀腺疾病以及自身免疫性疾病病史及家族史。③非感染、創傷等應激狀態。④肝腎功能、血脂正常。

1.3 研究方法

1.3.1 甲狀腺功能及 TPOAb、TgAb 滴度檢測 抽取受試者空腹靜脈血，分離血清用以檢測甲狀腺激素水平(TSH、FT3、FT4)及TPOAb、TgAb滴度。采用電化學發光法檢測，檢測所用儀器為羅氏E170C與E170B，試劑為Roche試劑盒。正常參考值范圍：TSH: 0.27～4.2 mIU/L；FT3：3.6～7.5 pmol/L；FT4：12.0～22.0 pmol/L；TPOAb：≤34 IU/mL；TgAb：≤115 IU/mL。

1.3.2 外周血單個核細胞(PBMC)的提取 采集各組受試對象空腹外周靜脈血3ml，肝素鈉抗凝，Ficoll密度梯度離心法分離獲得PBMC。

1.3.3 Treg染色分析 吸取 100uLPMBC，分別加入FITC-CD4、 APC-CD25單克隆抗體(BD Biosciences)，充分混勻后室溫避光孵育 30 min，用Foxp3 Staining Buffer Set(eBioscience)透膜/固定后進行 PE-Foxp3 單克隆抗體(BD Biosciences)避光染色30min，流式細胞儀上機檢測細胞，從分離出的PMBC中圈出CD4+T細胞，再從CD4+T群中圈出CD25+ 和Foxp3+ T細胞群，CD4+CD25+Foxp3+T細胞群即為Treg細胞。

1.3.4 Th17染色分析 取1×106細胞PMBC加入900ul RPMI-1640中，加入100ul原液胎牛血清，加入佛波酯(Sigma-Aldrich)、離子霉素(碧云天)、蛋白轉運抑制劑(碧云天)使其終濃度分別為50ng/ml、1ug/ml、10ug/ml；置于細胞培養箱(37℃ 5%CO2)刺激4小時。將刺激后細胞分離并加入FITC-CD4單克隆抗體(BD Biosciences)避光染色30min，用通透固定液(eBioscience)進行透膜/固定后進行 PE-IL17A 單克隆抗體(BD Biosciences)避光染色30min，流式細胞儀上機檢測細胞，從分離出的PMBC中圈出CD4+T細胞，再從CD4+T群中圈出IL17A+T細胞群，CD4+ IL-17A+T細胞即為Th17細胞。

2 結果

2.1 各組一般資料比較 HT組與正常對照組的TSH、FT3、FT4水平差異無統計學意義(P>0.05)；HT組TPOAb、TgAb的滴度明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。治療組與初發組的TSH、FT3、FT4水平差異無統計學意義(P>0.05)；初發組TPOAb和TgAb滴度的中位數水平，均明顯高于治療組，但差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 各組 PBMC中Treg細胞的比例 HT組外周血中Treg頻率(即Treg細胞群占CD4+的比例)與正常對照組比較差異有統計學意義(P=0.001)；治療組和初發組Treg細胞比例均低于對照組(P<0.05)，雖然治療組Treg細胞比例低于初發組，但差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1、表2。

表1 HT組和正常對照組一般臨床資料分析Table 1 The general clinical data between HT and control group

注：與對照組比較，①P>0.05；與對照組比較，②P<0.05;與初發組比較，③P>0.05

2.3 各組PBMC中Th17細胞的比例 與對照組相比，HT組外周血中Th17頻率(即Th17細胞群占CD4+的比例)有升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；初發組和治療組Th17細胞比例，均高于對照組，但差異均無統計學意義(P>0.05)；治療組與初發組Th17細胞比例差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1、表2。

圖1 流式細胞術分析 PBMC 中 Treg、 Th17 細胞所占比例Figure 1 The proportion of Treg and Th17 cells in PBMC by flow cytometry

2.4 各組 PBMC中Th17/ Treg比值 HT組外周血中Treg/Th17比值與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.001)；治療組Treg/Th17比值高于初發組，但兩組間差異無統計學意義(P>0.05)；治療組和初發組Treg/Th17比值均小于正常對照組(P<0.05)，見表2。

2.5 HT組外周血中Treg、Th17、Treg/Th17比值的影響因素分析 HT患者中，TgAb抗體滴度與外周血中Treg、Th17細胞數及Treg/Th17比值無明顯相關性(P>0.05)；TPOAb抗體滴度與外周血中Treg、Th17細胞數及Treg/Th17比值也無明顯相關性(P>0.05)。

Table2ComparisonsofTreg,Th17,Treg/Th17ratioamongeachgroup

組別nTreg(×10-2)Th17(×10-2)Treg/ Th17HT組454.98±2.71①1.45±0.66①3.12(1.88～5.73)① 治療組224.59±1.96②④1.33±0.77③④3.51(2.02～6.46)②④ 初發組235.38±3.39②1.57±0.50③2.86(1.44～5.42)②對照組277.89±3.751.19±0.687.2(3.7～13.01)

注：與對照組比較，①P<0.05；與對照組比較，②P<0.05；與對照組比較，③P>0.05；與初發組比較，④P>0.05

3 討論

Th17 及Treg 細胞是近年來發現的新型免疫細胞，具有獨立的分化和調節機制，且互相抑制。Treg、Th17細胞已被證實在自身免疫性疾病的發病中有著重要的作用[4]。Treg能夠阻止自身反應性T細胞的活化，并抑制自身免疫性疾病的發生[5]。而Th17是一種以分泌IL-17為主的T細胞亞群，其通過高分泌IL-17使促炎因子誘導多種前炎癥細胞因子和趨化因子的產生，繼而參與機體炎癥反應與免疫防御[4-7]。在類風濕性關節炎過敏性紫癜患者出現Treg、Th17細胞失衡，Treg / Th17比例也發生變化[8-9]。作為自身免疫性甲狀腺疾病之一的橋本氏甲狀腺炎，Treg、Th17細胞對其的作用也不容忽視。已有研究[2-3、10]發現，Treg、Th17細胞功能失衡在HT發病中也起了較為重要的作用。然而HT 患者外周血Treg/Th17 細胞軸的免疫失衡在甲狀腺功能正常期即已出現[11]。由此可見，Treg/Th17 細胞軸的免疫失衡貫穿于HT 的不同階段[12]。

相較于甲功正常和亞臨床甲減的HT患者，臨床甲減患者外周血中Treg細胞含量最低而Th17含量最高。Mao C等[13]的研究也發現，甲狀腺功能亢進的Graves病患者 Treg含量明顯低于藥物治療后甲功正常的Graves病人群。所以，甲狀腺功能的不同本身就可能對外周血中Treg、Th17細胞有一定的影響[14]。本研究發現雖然HT患者的外周血Treg/Th17比值均低于正常對照人群，但初發甲狀腺功能正常的HT患者(初發組)及HT伴甲減但予以L-T4治療將甲功維持正常的患者(治療組)兩組間Treg/Th17比值并不存在統計學差異。因此我們并沒有發現在HT 患者外周血Treg、Th17細胞含量在疾病的不同階段呈現進行性變化。推測HT 患者外周血Treg、Th17細胞含量在不同階段呈現出的變化可能是由于甲狀腺功能變化所致，而與HT患者的免疫炎癥反應的變化無直接關系。

由于Treg、Th17細胞是通過其調控因子如TGF-β、IL-6等介導的T 細胞異常免疫反應過程中發揮作用，從而參與了甲狀腺組織自身免疫損傷[15]。因此，即便Th17細胞或Treg細胞數量沒有變化，但其功能發生了改變，其相關調控因子水平發生了變化，也會影響免疫炎癥反應。說明在HT的發病中，Treg/Th17比值的變化對其橋本氏甲狀腺炎的病情的預測和判斷更具有意義。

既往研究[16-18]顯示L-T4可以使HT患者腫大的甲狀腺縮小。即便是甲功正常的HT患者，在予以L-T4治療后患者TPOAb抗體滴度出現明顯下降，而停用L-T4后，患者TPOAb逐漸升高。本研究發現雖然TPOAb、TgAb滴度在治療組和初發組之間無明顯的統計學差異，但從數值上看，L-T4替代治療后的HT患者的TPOAb、TgAb滴度低于初發HT人群。有學者指出[16]L-T4治療后HT患者的B淋巴細胞也出現明顯下降，提示L-T4的免疫治療作用可能是通過影響免疫細胞實現的，L-T4可通過減少B淋巴細胞來改善HT患者的自身免疫狀態。Bossowski A等[19]觀察到，未予以L-T4治療的HT患者Treg細胞數量較正常人群明顯減少，但L-T4治療6～12個月后Treg細胞數量逐漸恢復正常。可見，L-T4可以改善輔助性T 細胞和調節性T 淋巴細胞功能紊亂狀態，從而降低TPOAb、TgAb滴度。因此認為L-T4對HT可能具有一定的免疫調節作用。但本研究并未發現L-T4治療后HT患者與初發HT患者間外周血中Treg、Th17細胞數量及Treg/Th17比值的統計學差異，也未發現TPOAb抗體滴度與外周血中Treg、Th17細胞數量及Treg/Th17比值有明顯相關性。提示L-T4對TPOAb、TgAb抗體滴度影響的機制較為復雜，可能并不是單一通過影響Treg、Th17細胞功能來實現[20]。也有可能是L-T4替代治療后對TSH水平影響，使其對甲狀腺組織的刺激作用減少，使免疫炎癥反應減弱，從而減少TPOAb、TgAb產生[16]。有研究[21]提示可能存在其它未知因素參與調節SOCSl (suppressor of eytokine signaling l)和SOCS3 suppressor of eytokine signaling 3)的表觀遺傳學修飾，會影響HT的免疫炎癥反應。

4 結論

橋本氏甲狀腺炎的患者Treg細胞數量、 Treg/Th17比值明顯降低，Treg、Th17細胞功能失衡在HT發病中起重要作用。甲狀腺功能異常可能會影響Treg、Th17細胞功能。 L-T4替代治療可能會降低橋本氏甲狀腺炎患者TPOAb、TgAb滴度，但其作用機制可能并非單一通過影響Treg、Th17細胞功能實現的。