門冬胰島素原的酶切及產物分離純化方法*

周孟能 陳文瓊 陳穎 劉永東

(1.樂山市人民醫院, 四川 樂山 614000；2.中國科學院過程工程研究所, 北京 100190)

根據國際糖尿病聯盟(IDF)統計，2015年全球約4.15億糖尿病患者，這一人數到2040年預計達到6.4億[1-4]。隨著糖尿病人的數量迅速增加，胰島素的市場需求量也在逐年增加。目前，每年胰島素的需求量已經超過了16000kg[5]。

1982年，大腸桿菌表達的重組人胰島素上市[6-7]。根據不同需要對胰島素分子進行改造，可以制備出一系列速效或長效的胰島素類似物。與酵母相比，大腸桿菌具有發酵方法簡單，蛋白表達量高，生產成本較低等優點，是優先選擇的表達載體。門冬胰島素是一種速效的胰島素類似物，在糖尿病治療中占有重要地位[8-10]。同其它胰島素類似物一樣，門冬胰島素首先通過大腸桿菌表達為門冬胰島素原(pro-IAsp)，除含有成熟胰島素分子的A、B鏈外，在A、B中間還含有利于蛋白折疊所需的C肽[11-12]。需利用胰蛋白酶和羧肽酶對門冬胰島素原進行酶切[13-15]，去除C肽才能獲得具有生物活性的門冬胰島素分子。優化酶切過程及酶切后產物的分離純化對提高門冬胰島素的質量和產量均有重要意義。

1 材料與方法

1.1 門冬胰島素原酶切反應 門冬胰島素原由本實驗室自行制備，純度大于95%，蛋白濃度調整為0.3mg/mL，溶于20mMTris-HCl，pH8.5緩沖液。胰蛋白酶配制：取10 mg胰蛋白酶，加入1mL 1m MHCl溶解，濃度為10mg/mL；取10μL，加入990μL 1mMHCl稀釋至0.1mg/mL，分裝到10個0.5mL EP管中，-70℃保存備用。羧肽酶B配制：取10 mg 羧肽酶B加入1mL 超純水溶解，濃度為10mg/mL；取10 μL，加入990μL超純水稀釋至0.1mg/mL，分裝到10個0.5mL EP管中，-70℃保存備用。

取該門冬胰島素原溶液1mL，加入胰蛋白酶和羧肽酶B儲液3μL，混合均勻后，室溫下孵育。反應進行2 min，10min，30min后分別取150μL反應混合物，加入8μL乙酸終止反應。反相高效液相分析酶切產物，確定最優的酶切條件。

1.2 酶切產物純化 取門冬胰島素原溶液20 ml(0.35mg/mL)，在最優酶切條件下進行酶切反應，反應終止后，選擇SPFF對酶切后樣品進行純化。層析柱尺寸：1×10cm ID，介質體積8ml；buffer A：50mMNaAc，pH4.0；buffer B：50mMNaAc，pH4.0，1M NaCl。洗脫條件：0-100%B，15min線性梯度洗脫；流速：1mL/min；檢測波長：280nm。

1.3 RP-HPLC檢測方法[16]選用資生堂Proteonavi柱(4.6mm×250mm,waters2695-2996系統。流動相A：含0.1%TFA的超純水溶液；流動相B：含0.1%TFA的乙腈溶液。20%-50%流動相B/30分鐘；流速：0.5ml/min；采用280nm和214nm雙波長檢測。

1.4 HP-SEC檢測方法 高效凝膠過濾層析(HP-SEC)所用層析系統為AKTA purifer10(GE，美國)。所用凝膠層析柱為superdex peptide30(10×300nm)。上樣量為500μL。Buffer：2M urea、20mMTris-HCl、0.15 M Na2SO4、pH 8-8.5；檢測波長：214 nm、280nm。

1.5 MALDI-TOF檢測方法 通過MALDI-TOF方法檢測酶切純化后產物的分子量。所用儀器為AB SCIEX 5800 MALDI-TOF/TOF質譜儀。2μL蛋白樣品與CHCA在金屬板上混合點樣，自然干燥后，MALDI-TOF質譜儀進行分子量檢測。

2 結果

2.1 門冬胰島素原的酶切位點分析 門冬胰島素原的氨基酸從N端開始順序為前導肽(氨基酸1-3)、B鏈(氨基酸4-33)、C肽(氨基酸34-68)以及A鏈(氨基酸69-89)，而成熟胰島素僅含有A鏈和B鏈， AB鏈通過二硫鍵連接形成完整胰島素分子。胰蛋白酶的酶切位點為賴氨酸(K)、精氨酸(R)羧基之后的肽鍵；羧肽酶B作用位點為C端賴氨酸(K)或精氨酸(R)。根據ExPASyPeptideCutter工具計算，門冬胰島素原經胰蛋白酶和羧肽酶同時處理，酶切后可能產生如表所示的肽段。可以看出，使用兩種酶進行酶切時，可以同時除去N端的前導肽以及C肽，獲得完整的胰島素分子,見圖1、表1。

圖1 門冬胰島素原的氨基酸序列Fig 1 The amino acid sequence of proinsulin aspart注：紅色表示C肽序列

Table1Analysisofthepositionsofproinsulinaspartdigestedbycarboxypeptidaseandtrypsin

SiteResykting peptied sequencePosition2MK3R25FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER32FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKB chain34TR35R67EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKC peptide68R89GIVEQCCTSICSLYQLENYCNA chain

2.2 反相高效液相分析監測酶切過程 酶切反應2min時，214nm與280nm峰型一致，出峰時間相同，主峰在19.5min，但峰形已不再是單峰(見圖2a)。酶切反應進行10min時(見圖2b)，280nm處吸收峰發生分裂，吸收主峰位置向后轉移至20 min，即門冬胰島素的出峰位置。同時，在洗脫時間17 min左右出現了新的214nm吸收峰，應為被切下來的C肽的峰。可見隨著反應時間延長，主峰出峰時間逐漸向后轉移，反應30 min后(見圖2c)，主峰已經全部轉移至20 min處，推測門冬胰島素原已經全部轉化為門冬胰島素。對酶切產物進行SDS-PAGE電泳分析，可見在酶切10min時(見圖2d)，部分條帶從門冬胰島素原位置轉移至門冬胰島素位置，反應30 min后，門冬胰島素原幾乎全部轉化為門冬胰島素。

2.3 酶切后純化結果 門冬胰島素原酶切30min后，調酸至pH4.0終止反應，然后采用陽離子層析介質SP FF進行分離純化，去除C肽。將酶切樣品上樣至SPFF柱，采用0-100% B線性梯度洗脫，在280nm有一個洗脫峰(見圖3)。收集洗脫峰P，采用高效凝膠過濾柱Superdex Peptide30檢測.酶切后純化樣品為單一洗脫峰，表明經過SPFF純化后，酶切副產物C肽已經被除去，所獲得純化產物的純度大于95%(見圖4a)。MALDITOF檢測酶切純化產物的分子量為5826Da，而門冬胰島素理論分子量為5825.6Da，兩者幾乎完全一致(見圖4b)。該結果進一步證實，SPFF純化洗脫峰為門冬胰島素純品。分析洗脫峰蛋白濃度，計算純化過程目標蛋白收率約為30%。

圖2反相高效液相及SDS-PAGE監測酶切過程

Figure2RP-HPLCandSDS-PAGEanalysisofenzymedigestionat2min,10min,30min.Lane1:standardofinsulinaspart,lane2,3and4:proinsulinaspartdigestedfor2,10and30min,respectively

注：a、b、c分別為酶切2、10、30min 的反相高效液相圖;d.SDS-PAGE電泳結果

3 討論

人胰島素分子進入體內后，會形成二聚和六聚體，但起效時間較慢，不利于血糖控制。研究表明，B鏈靠近C-末端的數個氨基酸，尤其是B28、B29位的氨基酸與胰島素分子間的聚集關系密切[17]。因此，通過其氨基酸殘基而改變胰島素的藥代性質。長效胰島素如甘精胰島素，分子聚合能力增強，同時由于等電點變化導致在注射部位沉積，實現胰島素長時間平穩釋放，維持血液中的基礎胰島素濃度[18]；而速效胰島素的分子性質正好相反，分子間聚合能力降低，起效快，代謝周期短，用以替代體內餐食胰島素分泌，應對進食后血糖快速升高的情形[19-20]。門冬胰島素是一種速效胰島素，是在人胰島素分子基礎上將 B28脯氨酸(P)改為門冬氨酸(D)而成。由于引進陰離子門冬氨酸，電荷排斥作用增強，能阻止胰島素單體或二聚體的自我聚合，達到迅速起效的降糖作用。目前國內僅有諾和諾德的門冬胰島素在市場銷售，價格昂貴。因此，急需發展門冬胰島素的制備工藝，開發國內的門冬胰島素品種。

圖3門冬胰島素原酶切后SPFF純化
Figure3PurificationprofileofdigestedproinsulinaspartbySPFF

圖4 高效凝膠過濾及質譜檢測純化產物Figure 4 SEC (a) and Mass analysis (b) of purified product注：a.高效凝膠過濾及質譜;b.檢測純化產物

人胰島素和門冬胰島素等類似物均由A、B兩條肽鏈通過兩對二硫鍵連接形成。早期胰島素及類似物的生產通過分別制備A、B肽鏈，然后氧化連接形成胰島素分子。但這種方法的制備效率很低。胰島素在人體內首先合成的是含信號肽和C肽的前胰島素原，隨后在胰島B細胞的作用下降解形成胰島素分子。受此啟發，近年來利用基因重組技術生產胰島素也是表達含C肽的完整胰島素原分子，隨后通過酶切來獲得正確結構恢復胰島素活性[21]。A、B鏈中間的C肽能促進胰島素原在體內及體外的正確折疊，將A、B鏈表達在同一肽鏈能極大提高制備效率[22]。另外，為避免大腸桿菌表達重組蛋白時N端出現多余的甲硫氨酸，可在胰島素原的N端引入胰蛋白酶的酶切位點(MKR)，多余的甲硫氨酸在酶切過程中可隨C肽同時去除。

雖然C肽能增加胰島素原蛋白表達，輔助其正確折疊，但胰島素原無降糖活性，必須通過酶切去除C肽，因此酶切過程對最終產品的活性及質量至關重要。門冬胰島素原分子中含多個胰蛋白酶和羧肽酶B的酶切位點，如25位精氨酸(R)位點被切開后會導致B鏈被切為兩截。不同位點鄰近氨基酸序列以及空間結構不同，因此酶切反應的難易程度也不完全相同。因此，酶切過程中需要嚴格控制反應時間，避免產生多余的酶切片段。酶切過程中，酶與底物的比例、作用時間、酶活等都對產物生成有重要影響，作用時間太長會導致B鏈被切割成兩部分，時間太短會導致B鏈C端含多余的精氨酸，這些酶切產物不僅會降低最終產品比活，同時也給后續的分離純化帶來極大難度。門冬胰島素原含酪氨酸(Y)和苯丙氨酸(F)，它們所具有的芳香族氨基酸使得門冬胰島素原在280nm處有紫外吸收，而酶切之后形成C肽不含有上述芳香族氨基酸，酶切之后新生成的C肽在280nm沒有吸收，可通過214nm的波長進行監測。酶切后的門冬胰島素(包含A、B兩條肽鏈)則在兩種波長下均有吸收，因此，反相高效液相分析同時采用兩種波長監測酶切產物可清楚反應酶切進行程度。對門冬胰島素原，胰蛋白酶和羧肽酶B采用質量比1：1000時，30min即可酶切完全，同時沒有發現B鏈被切割的現象。離子交換層析具有分離效果好處理量大的優點，并且易于放大。酶切產物經一步陽離子交換層析門冬胰島素純度提高至95%，并且收率為30%以上。純化的門冬胰島素分子量與理論值完全一致，再次證明了所采用的酶切條件沒有產生不完整或含多余氨基酸的肽鏈。本論文研究結果對門冬胰島素的規模制備奠定基礎，同時對其它胰島素類似物的生產有指導意義。

4 結論

門冬胰島素可通過酶切大腸桿菌表達的含多余C肽的門冬胰島素原獲得。這種策略制備過程簡單，生產周期短，能降低藥物價格。門冬胰島素原的酶切工藝，獲得了完整的門冬胰島素分子結構，并通過一步離子交換層析獲得純度95%以上的具有正確結構的門冬胰島素。門冬胰島素原的酶切及分離純化工藝可用于指導門冬胰島素的規模制備。