松香多元酸對小地老虎的拒食活性研究

許 吉, 翟兆蘭, 宋湛謙, 商士斌,2, 饒小平,2*

(1.中國林業科學研究院 林產化學工業研究所；生物質化學利用國家工程實驗室；國家林業局 林產化學工程重點開放性實驗室；江蘇省 生物質能源與材料重點實驗室， 江蘇 南京 210042； 2.中國林業科學研究院 林業新技術研究所， 北京 100091)

小地老虎(Agrotisypsilon)，又名土蠶、切根蟲，分布于全國各地，是雜食性害蟲，食性較廣，不僅危害棉花、玉米、小麥、高粱等農作物，而且也危害水曲柳、胡桃楸及紅松等林木幼苗[1]。目前對小地老虎主要采用化學農藥防治方法，主要農藥種類包括菊酯類和有機磷類，但化學農藥的廣泛使用不僅會污染環境，同時也容易使害蟲產生抗藥性[2]。隨著現代農業和生態環境保護對無公害農藥的迫切需求以及有害生物綜合治理共識的形成，昆蟲拒食劑因具有使用安全、對環境友好、不易產生抗藥性等優點而越來越被重視，成為無公害農藥中的重要品種[3]。昆蟲拒食劑不直接殺滅昆蟲，而是主要通過干擾昆蟲的取食行為達到保護作物的目的，因此昆蟲拒食劑的使用不會造成生態鏈的破壞[4>-5]。常見的昆蟲拒食劑包括萜類、生物堿、酚類、醌類、香豆素類、糖類等不同類型的化合物，主要是通過提取分離植物次生物質來獲得，其中萜類化合物是研究最多的一類拒食劑，萜類拒食劑主要包括單萜類、倍半萜類、二萜類和三萜類[6>-10]。通過對天然產物中的主要成分進行結構修飾，可以大大提高其生物活性。松香是一種具有重要價值的天然萜類樹脂，是由松樹分泌的松脂經過蒸餾分離而得，松香的主要成分是樹脂酸，樹脂酸的結構中含有共軛雙鍵及羧基，可以通過加成、酯化等化學反應引入一系列的官能團。松香具有三環二萜結構，是生物醫藥及生物農藥的良好起始原料[11]。前期研究發現，脫氫樅酸的酯類衍生物對粘蟲、蚜蟲等害蟲具有一定的拒食活性，松香酸離子液體衍生物對鱟蟲、赤擬谷盜蟲和谷斑皮蠹等農作物害蟲具有較強的拒食效果[12>-13]。本研究以松香為原料經Diels-Alder加成反應合成丙烯海松酸、富馬海松酸及馬來海松酸等松香多元酸，研究了其對小地老虎的拒食活性，以期為篩選出高活性的植物源昆蟲拒食劑提供參考。

1 實 驗

1.1 松香多元酸制備

根據文獻[14～17]的方法合成及提純脫氫樅酸、丙烯海松酸、富馬海松酸和馬來海松酸。由于松香樹脂酸結構中含有共軛雙鍵，與不飽和酸進行Diels-Alder加成反應后可以得到松香多元酸。松香與丙烯酸加成產物為丙烯酸松香，經過鈉鹽法重結晶可得到丙烯海松酸[15]，松香與富馬酸加成產物為富馬酸松香，經過鈉鹽法重結晶得到富馬海松酸[16]，松香與馬來酸酐加成產物為馬來松香，馬來松香經過溶劑重結晶可以得到馬來海松酸[17]。為了研究松香多元酸結構變化對拒食活性的影響，將3種松香多元酸與未加成的脫氫樅酸進行活性對比。松香多元酸及脫氧樅酸的結構如圖1所示。

圖1 松香多元酸及脫氫樅酸的結構Fig. 1 Structure of polyacid derivatives of rosin and dehydroabietic acid

1.2 供試幼蟲和植物的培養

小地老虎(Agrotisypsilon)為室內繼代人工飼養。飼養條件：溫度(25±1) ℃，相對濕度(75±5)%，光周期為光照16 h、黑暗8 h(L16∶D8，h∶h，下同)，培養10天。選擇大小整體一致的4齡初幼蟲供試。甘藍(BrassicaoleraceaL.)為溫室人工栽培，未接觸任何化學藥劑。

1.3 樣品對小地老虎4齡幼蟲的拒食率測定

采用浸葉法進行拒食活性的測定。用少量乙醇溶解樣品，然后用0.1%吐溫-80水溶液配成質量濃度1.0 g/L的樣品溶液作為試驗組測試，0.1%吐溫-80水溶液作為對照組進行測試。將新鮮甘藍葉片洗凈、晾干，用打孔器打成直徑2.0 cm，面積為314 mm2的葉碟，分別在質量濃度為1.0 g/L的藥液中浸泡10 s后，取出自然風干，放入12孔養蟲板中，每孔1片共放10個孔(10組實驗)，分別接入1只饑餓處理4 h的生長一致的4齡小地老虎幼蟲。將試蟲置于(27±1) ℃、相對濕度(75±5)%、光周期L16∶D8條件下，用浸泡處理后的葉碟對幼蟲進行飼養，于24 h后將殘存的葉碟取出，用1 mm×1 mm標準方格紙分別測量試驗組和對照組葉碟剩余面積，取平均值計算拒食率。拒食率(%)=(對照組取食面積試驗組取食面積)/對照組取食面積×100%。

1.4 松香多元酸對小地老虎4齡幼蟲的拒食中濃度測定

將丙烯海松酸和富馬海松酸分別用0.1%吐溫-80水溶液稀釋配制成3～4個系列濃度，將制得的新鮮甘藍葉碟分別在各濃度藥液中浸泡10 s，取出自然風干，放入12孔養蟲板中，每孔1片共放10個孔，分別接入饑餓處理4 h的生長一致的4齡小地老虎幼蟲，每孔1頭試蟲。以0.1%吐溫-80水溶液為對照。將處理后試蟲置于(27±1) ℃、相對濕度(75±5)%、光周期L16∶D8條件下，對幼蟲進行飼養，于24 h后將殘存的葉碟取出，利用1 mm × 1 mm標準方格紙分別測量試驗組和對照組葉碟剩余面積，計算拒食率。拒食率為50%時的樣品濃度即拒食中濃度(AFC50)的計算方法參照陳立等[18]的方法，將拒食率轉化為概率值y、衍生物質量濃度轉化成對數x，利用DPS v7.05軟件得到拒食率回歸方程y=ax+b，其中b表示回歸方程的截距，a表示回歸方程的斜率，并用該回歸方程計算拒食率為50%時的樣品質量濃度，即拒食中質量濃度(AFC50)。使用DPS v7.05處理試驗數據，求得平均值和標準誤(SE)，差異顯著性采用Tukey法進行比較。

2 結果與討論

2.1 樣品對小地老虎的拒食率

松香多元酸及脫氫樅酸對小地老虎的取食面積及拒食率列于表1中，試驗中發現質量濃度為 1.0 g/L 的樣品對小地老虎幼蟲無致死作用。由表中數據可以看出，丙烯海松酸及富馬海松酸處理過的葉蝶中，小地老虎的取食面積大大減少，在1.0 g/L質量濃度下拒食率分別為78.41%和79.94%，較大地抑制了幼蟲的取食；馬來海松香表現出微弱的拒食活性，拒食率為13.41%；而未加成的脫氫樅酸拒食率僅為0.68%，幾乎無拒食作用。由此可見，脫氫樅酸結構中有一個羧基，拒食活性較弱，丙烯海松酸及富馬海松酸結構中分別含有2個和3個羧基，具有較強的拒食活性，而馬來海松酸中含有一個羧基及一個酸酐結構，拒食活性也較弱。樣品對小地老虎的取食面積標準偏差及95%置信區間(95%置信區間就是總體參數在這個范圍的可能性大概是95%,或者說總體參數在這個范圍,但其可信程度只有95%)數據列于表2中，從表中數據可以看出，馬來海松酸對小地老虎取食面積測試結果標準差較大，測試結果的離散程度較大，而丙烯海松酸和富馬海松酸的標準差較小，測試結果的離散度較小，說明丙烯海松酸和富馬海松酸的測試結果代表性更好。

表1 樣品對小地老虎的取食面積及拒食率

表2 樣品對小地老虎的標準偏差及95%置信區間

2.2 松香多元酸對小地老虎的拒食中濃度

初篩結果表明丙烯海松酸、富馬海松酸對小地老虎具有較強的拒食作用，因此對這2種松香多元酸進一步研究，測定了不同質量濃度的松香多元酸樣品對小地老虎4齡幼蟲的拒食率，進一步計算拒食中質量濃度(AFC50)。不同質量濃度松香多元酸對小地老虎的拒食率列于表3中。由表3數據可見丙烯海松酸、富馬海松酸對小地老虎的拒食率隨著質量濃度的增加相應提高。丙烯海松酸、富馬海松酸對小地老虎的拒食率回歸方程分別為y1=6.29x+0.89和y2=6.20x+1.01,拒食作用相關系數及95%置信區間如下：相關系數分別為0.989 2和0.987 4，說明2種化合物的拒食活性與質量濃度關系密切，拒食中質量濃度(AFC50)分別為0.04和0.06 g/L，95%置信區間分別為0.02～0.05及0.05～0.09 g/L，丙烯海松酸的拒食中質量濃度稍低于富馬海松酸。

表3 不同質量濃度松香多元酸對小地老虎的拒食率

目前對小地老虎的防治主要采用化學農藥防治方法，主要化學農藥包括菊酯類及有機膦類，容易造成環境惡化、生態鏈破壞及害蟲產生抗藥性。而使用拒食劑這種環保農藥對小地老虎的防治目前報道較少，呂敏[19]研究了從蕓香科植物白鮮根皮中分離得到的梣酮對小地老虎的拒食活性，其中梣酮具有四降三萜骨架上的呋喃環和C，D-環結構，是研究較多的一種天然降解的檸檬苦素類似物，梣酮對2齡小地老虎幼蟲24 h時的拒食中質量濃度(AFC50)值為13.40 g/L。Jeyasankar[20]研究表明，植物精油、桉葉油及白珠油對小地老虎有較強的拒食活性，2%時拒食率分別達到92.245%及87.21%，拒食中濃度在0.5%～1%之間。相比之下，丙烯海松酸及富馬海松酸對小地老虎的拒食活性比梣酮、白珠油及桉葉油的活性強。

松香多元酸對小地老虎4齡幼蟲具有較高拒食活性，可有效降低小地老虎的取食量，減輕其對寄主植物的危害。丙烯海松酸、富馬海松酸對小地老虎的拒食中質量濃度較低，下一步將進行田間試驗，以明確其在生產中的實際防治效果。

3 結 論

3.1研究了松香多元酸丙烯海松酸、富馬海松酸、馬來海松酸對小地老虎(Agrotisypsilon)的拒食活性，同時與未加成的脫氫樅酸進行活性對比。結果表明：質量濃度為1.0 g/L時脫氫樅酸、丙烯海松酸、馬來海松酸和富馬海松酸對小地老虎的24 h拒食率分別為0.68%、 78.41%、 13.41%和79.94%。其中，丙烯海松酸及富馬海松酸對小地老虎的拒食活性較高，較大地抑制了幼蟲的取食，馬來海松酸的拒食活性較弱。

3.2研究了丙烯海松酸及富馬海松酸對小地老虎的拒食中質量濃度(AFC50)，結果表明二者均具有較低的AFC50，AFC50分別為0.04 和0.06 g/L，其拒食活性比梣酮、白珠油及桉葉油強。